李忠斌 ，吳 欣 ，宮 嫚 ，羅生強(qiáng)

1.解放軍第三〇二醫(yī)院肝纖維化無(wú)創(chuàng)診療中心，北京 100039；2.解放軍第三〇二醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病診療與研究中心，北京 100039

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因、多誘因、多階段的過(guò)程，隨著癌細(xì)胞的增殖，耗氧量增加，導(dǎo)致癌組織嚴(yán)重缺氧。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是缺氧狀態(tài)下廣泛存在于多種腫瘤細(xì)胞中的一種關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在缺氧環(huán)境中表達(dá)顯著增加，激活缺氧反應(yīng)性基因表達(dá)，與癌細(xì)胞的能量代謝、血管生成、增殖和轉(zhuǎn)移、耐受放化療和預(yù)后等密切相關(guān)[1]。另外，在癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中存在細(xì)胞黏附分子及其介導(dǎo)的黏附行為的改變，E-選擇素（E-selectin）是黏附分子選擇素家族中重要的一員，E-選擇素及其配體唾液酸化路易斯寡糖-X（sialvl lewis-X，sLeX）在HCC癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用[2]。筆者應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了部分肝細(xì)胞癌及正常肝組織標(biāo)本中HIF-1α、E-選擇素與配體sLeX的表達(dá)，探討了其對(duì)肝癌的臨床評(píng)價(jià)價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集我院2005年1～12月肝癌手術(shù)切除的癌灶組織標(biāo)本45份，均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為肝細(xì)胞肝癌，所有患者術(shù)前均未接受過(guò)化療、放療、介入等治療。45例HCC患者中，男30 例，女 15 例；年齡 33～75 歲，平均（52.6±8.5）歲；TNM 分期為：Ⅰ期2例，Ⅱ期15例，Ⅲ期25例，Ⅵ期3例；細(xì)胞分化程度：高度分化13例，中度分化22例，低度分化10例。全部受試患者均有完整的病歷資料、病理診斷和隨訪資料，另隨機(jī)選擇45份正常肝組織標(biāo)本作為對(duì)照組。

1.2 方法

將石蠟包埋的癌灶組織、正常肝組織標(biāo)本制成5 μm厚的石蠟切片，常規(guī)處理，免疫組化采用鏈霉親合素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法（SP），兔抗人HIF-1α抗體購(gòu)自武漢博士德公司，鼠抗人E-選擇素單抗購(gòu)自法國(guó)IMMUNOTECH公司，鼠抗人sLeX單抗購(gòu)自日本Aichi腫瘤中心，SP試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)公司，免疫組化按說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，同時(shí)設(shè)置陰性及陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判讀

參考董志珍等[3]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行HIF-1α結(jié)果判讀：HIF-1α主要位于細(xì)胞質(zhì)中，部分胞核中亦有表達(dá)；以細(xì)胞呈均勻一致清晰棕黃色為陽(yáng)性，按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例分為：① 陰性（-）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%；②弱陽(yáng)性（+）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占10%～25%；③中等陽(yáng)性（++）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占 26%～50%；④強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%。參考錢世鯤等[4]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行E-選擇素、sLeX結(jié)果判斷：E-選擇素表達(dá)特征為癌灶邊緣血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色染色，sLeX的表達(dá)為肝癌細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色染色；隨機(jī)選取5個(gè)視野，在400×顯微鏡下觀察，染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>5%為陽(yáng)性，染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，半定量等級(jí)資料比較采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α、E-選擇素、sLeX在肝癌與正常肝組織中的表達(dá)

表1 肝癌及正常肝組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α、E-選擇素、唾液酸化路易斯寡糖-X表達(dá)情況[n(%)]

2.2 肝癌高、中低分化組中HIF-1α、E-選擇素、sLeX的表達(dá)

HIF-1α、E-選擇素、sLeX在肝癌高、中低分化組中的表達(dá)情況如表2所示，高度分化組HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)率為23.08%，中低分化組HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)率為87.50%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.02，P＜0.01）。 E-選擇素、sLeX在高、中低分化組中的陽(yáng)性表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HIF-1α、E-選擇素、sLeX 與肝癌分化程度呈負(fù)相關(guān)（rH=-0.46，rE=-0.34，rs=-0.31，P＜0.01 或 P＜0.05）。

2.3 肝癌TNM分期中HIF-1α、E-選擇素、sLeX的表達(dá)

肝癌TNM分期中HIF-1α、E-選擇素、sLeX的表達(dá)情況如表3所示，HIF-1α、E-選擇素、sLeX與肝癌TNM分期呈正相關(guān)性（rH=0.32，rE=0.35，rs=0.36，均 P＜0.05）。

2.4 HIF-1α、E-選擇素、sLeX表達(dá)與肝癌預(yù)后的關(guān)系

截至2010年12月，45例肝癌患者中，存活20例，5年存活率為44.45%；死亡25例。HIF-1α、E-選擇素、sLeX表達(dá)與肝癌預(yù)后的關(guān)系如表4所示，可見HIF-1α表達(dá)為（++～+++）、E-選擇素表達(dá)為（+）、sLeX 表達(dá)為（+）者，其 5 年存活率偏低， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05或P＜0.01）；HIF-1α、E-選擇素、sLeX 與肝癌預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（rH=-0.53，rE=-0.43，rs=-0.36，P＜0.01 或＜0.05）。

肝癌及正常肝組織中HIF-1α、E-選擇素、sLeX陽(yáng)性表達(dá)情況如表1所示，肝癌組織中HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)率為68.89%，正常肝組織中HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)率為8.89%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=34.08，P＜0.01）。肝癌組織中E-選擇素、sLeX的陽(yáng)性表達(dá)率分別為66.67%、64.45%，正常肝組織內(nèi)未見E-選擇素、sLeX表達(dá)。

表2 肝癌高中低分化組中缺氧誘導(dǎo)因子-1α、E-選擇素、唾液酸化路易斯寡糖-X表達(dá)情況[n(%)]

表3 肝癌TNM分期中缺氧誘導(dǎo)因子-1α、E-選擇素、唾液酸化路易斯寡糖-X的表達(dá)情況（例）

表4 缺氧誘導(dǎo)因子-1α、E-選擇素、唾液酸化路易斯寡糖-X表達(dá)與肝癌預(yù)后的關(guān)系（例）

3 討論

隨著實(shí)質(zhì)性腫瘤的生長(zhǎng)，增大到一定體積時(shí)，缺氧是其微環(huán)境的基本特征，此時(shí)可誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列特異性的與血管新生、缺氧代謝密切相關(guān)的基因和蛋白，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是腫瘤新生血管生成的主要因素，而VEGF是HIF-1α的主要靶基因，通過(guò)激活HIF-1α通路上調(diào)VEGF的表達(dá)[5]。在正常組織中幾乎檢測(cè)不到HIF-1α，其原因在于HIF-1α在正常氧分壓時(shí)很不穩(wěn)定，易被泛素依賴的蛋白水解酶水解[6]。本研究顯示，肝癌組織及正常肝組織HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)率分別為68.89%和8.89%，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致。HIF-1α廣泛存在于胃癌、肝癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。丁磊等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在肝硬化組織中，以位于肝靜脈周圍的肝細(xì)胞以及腫瘤邊緣被壓扁的肝組織條索中HIF-1α表達(dá)最強(qiáng)，在肝癌中HIF-1α的表達(dá)均勻一致，癌旁肝硬化組織的表達(dá)均強(qiáng)于肝癌組織，這可能與以下因素有關(guān)：①肝組織缺血、缺氧使HIF-1α表達(dá)上調(diào)，小葉中央靜脈周圍肝細(xì)胞缺氧明顯；②組織結(jié)構(gòu)異常、血液動(dòng)力學(xué)紊亂、細(xì)胞缺氧微環(huán)境；③多種癌基因的失活及癌基因的激活，上調(diào)HIF-1α的表達(dá)。

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，黏附分子具有重要的作用，錢世鯤等[4]認(rèn)為E-選擇素主要作用于早期黏附，通過(guò)與炎癥反應(yīng)類似的機(jī)制參與腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，高表達(dá)的E-選擇素在腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中具有重要的作用，可作為臨床預(yù)后和術(shù)后早期復(fù)發(fā)的評(píng)估依據(jù)之一[8]。

本研究顯示，肝癌細(xì)胞的分化程度與HIF-1α、E-選擇素、sLeX表達(dá)具有一定的關(guān)系，具體表現(xiàn)為細(xì)胞的分化程度低，HIF-1α、E-選擇素、sLeX表達(dá)陽(yáng)性程度高，而細(xì)胞的分化程度高，HIF-1α、E-選擇素、sLeX表達(dá)陽(yáng)性程度低。而HIF-1α、E-選擇素、sLeX表達(dá)與肝癌TNM分期具有顯著的正相關(guān)性。在評(píng)價(jià)肝癌預(yù)后方面，HIF-1α、E-選擇素、sLeX陽(yáng)性程度愈高，其預(yù)后愈差。綜上可見，HIF-1α、E-選擇素、sLeX與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與預(yù)后具有重要的關(guān)系，全面考慮患者的臨床資料，結(jié)合HIF-1α、E-選擇素、sLeX對(duì)肝癌患者進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[1]李?yuàn)檴?姚登福,董志珍.肝缺氧誘導(dǎo)因子-1α與肝癌發(fā)生、發(fā)展及治療研究新進(jìn)展[J].世界華人消化雜志,2010,18(4)：361-367.

[2]張寶華,陳漢,姚曉平,等.E-選擇素及其配體sLeX在肝癌轉(zhuǎn)移中的意義[J].中華外科雜志,2000,38(7)：534-536.

[3]董志珍,姚登福,李?yuàn)檴?等.肝癌組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α的動(dòng)態(tài)表達(dá)特征及其臨床價(jià)值[J].中華肝臟病雜志,2010,18(7)：506-510.

[4]錢世鯤,陳德,李悅,等.E-選擇素及其配體表達(dá)對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的臨床意義[J].中華肝臟病雜志,2010,18(6)：440-444.

[5]Copple BL，Bustamanten Welch TP,Kim ND,et al.Hypoxia inducible factor-1α dependent production of profibrotic mediators by hypoxic hepatocytes[J].Liver Int,2009,29：1010-1021.

[6]Semenza GL.Regulation of oxygen homeostasis by hypoxia-inducible factor-1α [J].Physiology(Bethesda),2009,24：97-106.

[7]丁磊,陳孝平,王海平.缺氧誘導(dǎo)因子-1α蛋白在肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J].中華肝臟病雜志,2004,12(11)：656-659.

[8]Song G,Ohashi T,Sakamoto N,et a1.Adhesive force of human hepatoma HepG2 cells to endothelial cells and expression of E-selectin[J].Mol Cell Biomech,2006,3：61-68.