王 建,唐麗娟,2,劉瑋煒,馬衛(wèi)興,陳 龍
(1.淮海工學院江蘇省海洋生物技術重點實驗室,江蘇 連云港 222005;2.中國礦業(yè)大學,江蘇 徐州 221116)
1875年Kuhne認為源自生物中一種呈色物質含有吲哚核。1892年Neumeister定名為色氨酸。1907年Ellinger提出色氨酸的結構式,F(xiàn)lamand用化學合成法加以確定。色氨酸以游離或結合態(tài)廣泛存在于生物中。L-色氨酸呈白色或略帶黃色的葉片狀結晶或粉末,在稀酸或稀堿中溶解。它與酸在暗處加熱或在堿液中都較穩(wěn)定,但存在其他氨基酸或糖類時則易分解,與水共熱則產(chǎn)生少量吲哚。L-色氨酸如在NaOH、CuSO4存在下加熱,則產(chǎn)生大量吲哚[1]。目前,國內(nèi)外有關D-色氨酸的研究報告仍較少[2-4]。
獲得高質量色氨酸單晶體的難度很大,至今在劍橋晶體數(shù)據(jù)庫中收錄的幾個結構數(shù)據(jù)都是DLTrp的。如Erik Bye等[5]1973年通過 X-射線衍射法測定 DL-Trp 甲酸鹽晶體結構。Bakke等[6]1980年將DL-Trp溶于熱吡啶冷卻后得到的 DL-Trp晶體,將DL-Trp溶于熱草酸水溶液,經(jīng)緩慢冷卻制得 D-Trp草酸氫鹽晶體。Christian B 等[7]報道 LTrp甲酸溶劑化物晶體在183 K下測定的結構。Hübschle CB 等[8]通過將 DL-Trp 溶于溫熱的異丙醇-甲酸飽和溶液緩慢冷卻得到晶體并在173 K下測定結構。本文作者原打算以L-Trp和碳酸釹為原料,通過混合溶劑熱法制得L-Trp和釹的配合物,卻意外地得到高產(chǎn)率的DL-Trp單晶體。在反應體系中,Trp分解現(xiàn)象遠少于一般過渡金屬離子與Trp的反應。經(jīng)單晶X衍射分析對其結構進行了確定,還進行了紅外表征和分析,并運用旋光度測定方法研究了構型的轉變過程。該發(fā)現(xiàn)對開發(fā)和應用新型穩(wěn)定的氨基酸類藥物釋放載體結晶材料具有重要價值[9]。
傅立葉變換紅外光譜儀,B型,美國 PE;Bruker SMART 1000 CCD單晶衍射儀。L-Trp為生化試劑 (國藥集團化學試劑有限公司),碳酸釹為化學純 (連云港麗港稀土有限公司),無水甲醇為分析純。所有試劑使用前未經(jīng)進一步處理。25 mL壓力釜 (上海羌強實業(yè)發(fā)展有限公司)。101A-2數(shù)顯電熱鼓風干燥箱 (上海浦東欣悅科學儀器廠)。
1.2.1 LD-Trp 的制備 稱取 L-Trp(圖 1)0.406 4 g(2.0 mmol),加入體積比為1∶1的去離子水和甲醇混合溶劑15 mL,不斷攪拌使之完全溶解,形成透明溶液。將0.235 0 g(0.5 mmol)碳酸釹倒入上述溶液中,攪拌均勻。將混合液轉入25 mL容量的特氟隆內(nèi)膽,用不銹鋼壓力釜密封。置于電熱鼓風干燥箱中,升溫至150℃,保溫72 h后,緩慢以2℃/h降至100℃,再以5℃/h降至室溫(30℃)。得到圖2所示淺棕黃色長片狀晶體,產(chǎn)率97.12%。產(chǎn)物在熔點前分解,熔點低于L-Trp(280~285℃)。該晶體不溶甲醇、乙醇、DMF和DMSO。
1.2.2 紅外光譜 DL-Trp單晶的 IR(KBr壓片)如圖3所示。
圖3 DL-Trp的紅外光譜Fig.3 FTIR spectrum of DL-Trp
1.2.3 DL-Trp的晶體結構測定 選取尺寸大小為0.17 mm ×0.15 mm ×0.03 mm 的單晶體置于單晶衍射儀上,在298(2)K下,用經(jīng)石墨單色器單色化的 MoKα射線 (λ =0.071 073 nm),以 φ-ω 掃描方式收集衍射數(shù)據(jù)。在2.20°≤θ≤25.01°范圍內(nèi)收集到4 751個衍射點,其中獨立衍射點1 720個(Rint=0.167 8),I>2σ (I)的可觀測點746個?;衔锏慕Y構采用SHELXS-97程序由直接法解出。對非氫原子坐標及其各向異性溫度因子進行全矩陣最小二乘法精修,所有計算在PC機上用SHELXL-97程序包完成。其它相關晶體學數(shù)據(jù)列于表1。
表1 DL-Trp的晶體學數(shù)據(jù)和結構參數(shù)Table 1 Crystallographic data of DL-Trp
產(chǎn)物的選擇鍵長和鍵角如表2所示。氫鍵參數(shù)如表2所示。
1.2.4 不定形L-Trp固體在混合溶劑熱條件下轉變?yōu)镈L-Trp單晶體過程的旋光度測定 稱取L-Trp 1.016 g(5.0 mmol),加入體積比為1∶1 的去離子水和甲醇混合溶劑150 mL,攪拌使之溶解形成透明溶液,再加去離子水100 mL定容至250 mL。將0.235 0 g(0.5 mmol)碳酸釹倒入上述溶液中,攪勻。將混合液分成10組轉入25 mL容量的特氟隆內(nèi)膽,用不銹鋼壓力釜密封。置于電熱鼓風干燥箱中,升溫至150℃,保溫72 h(期間每隔24 h取出一組測旋光度),緩慢以2℃/h降溫,每降30℃取出一組測旋光度,降到30℃為止。所得溶液為淺棕黃色,經(jīng)離心后取清液進行旋光度的測定。觀測旋光度隨時間的變化情況如圖4所示。
圖4 兩次測定L-Trp構型轉變過程旋光度-時間曲線的對比Fig.4 Curves of optical rotation α and reaction time of L-Trp configuration transforming by twice measurement
將圖4所示L-Trp在碳酸釹存在下構型變化過程中兩次重復測定體系旋光度α/(°)隨時間t/h的變化曲線進行對比,可發(fā)現(xiàn)體系旋光度開始均為負值,隨時間變化,負值趨小,最后接近為零(水的旋光度)。
比較L-Trp和圖3的DL-Trp紅外光譜,主要相關吸收峰的變化由表3顯示。由于分子中有,出現(xiàn)3 403 cm-1N-H伸縮吸收峰,3 030~2 060 cm-1間的的3個峰分別歸屬于苯環(huán)上C-H鍵的特征吸收,其中主要峰從3 038(S)→3 045(S),波數(shù)略增。羧基中強的C=O吸收從1 667→1 663 cm-1,波數(shù)略減。1 591(S)cm-1峰則裂分為1 584(S)和1 610(S)cm-1雙峰,1 414(m)cm-1峰未變化,分別歸屬于面內(nèi)彎曲和。739 cm-1歸屬于吲哚氮的振動吸收峰,與L-Trp的744 cm-1相比有所減小,但吲哚氮未明顯參與氫鍵作用。
表2 DL-Trp的鍵長和鍵角Table 2 Bond lengths and angles of DL-Trp
表3 DL-Trp和 L-Trp的紅外光譜比較Table 3 FTIR analysis of DL-Trp and L-Trp
為了證明形成DL-Trp型單晶過程中D-Trp是由部分L-Trp轉型而來,作者專門對生產(chǎn)廠商的LTrp試劑產(chǎn)品質量進行了核實,并測定了試劑LTrp的比旋光度。結果表明DL-Trp中D-Trp確由部分L-Trp轉型而來。有趣的是L-Trp在一般條件下不穩(wěn)定易分解,而在碳酸釹存在下形成單晶時,不僅發(fā)生部分轉型,而且依賴NH3+和COO-間的N-H…O氫鍵締合作用與D-Trp一起形成很穩(wěn)定的單晶體。由于量化計算的軟硬件條件和技術水平的限制,作者未能對L-Trp與D-Trp形成相應的單晶體結構作理論計算。對于L-Trp轉型的原因,雖然LTrp與其他氨基酸相比并不易發(fā)生消旋化,但與pH及溫度呈現(xiàn)正相關性。有關L-氨基酸在熱堿及高溫、高壓和一定時間等條件作用下發(fā)生異構化或消旋化的研究,并從各種L-氨基酸結構特點來探索其變化的規(guī)律性曾有報道[10-15]。L-Trp 的雜環(huán)基團為吲哚基,由于亞甲基與吡咯環(huán)產(chǎn)生σ-π超共軛效應,使β-C原子電子向吡咯環(huán)轉移。吡咯環(huán)氮原子上孤對電子可與苯環(huán)產(chǎn)生p-π共軛效應,而使電子進一步向苯環(huán)分散。這兩個共軛效應使α-C電子密度大為降低,共振為烯胺構型的量也降到最少。
作者認為在Trp與過渡金屬離子M2+形成配位聚合物或在碳酸釹存在下形成DL-Trp單晶體時,L-Trp為了滿足晶體結構對稱性的需要,在溶液的pH值 (弱堿性)及溶劑效應 (超臨界)的影響下,克服空間位阻效應,使一定量的L-Trp改變其構型形成D-Trp。這一點也被目前所獲得的部分實驗事實所證實[16-21]:即通過水熱及有機溶劑熱法只能得到 [M(D-Trp)(L-Trp)]n型聚合物,而無法得到 [M(L-Trp)2]n或 [M(D-Trp)2]n型聚合物。而且目前色氨酸的單晶體也只能得到外消旋體 DL-Trp。
在水熱條件下,適合的過渡金屬離子作為模板劑,可使部分L-Trp通過先形成烯胺構型再逐漸轉變?yōu)镈-Trp。在L-Trp和D-Trp之間存在轉換平衡,通過結晶和從溶液體系析出方式使該平衡發(fā)生移動,因此有利于低能量構型的配位聚合物和外消旋體DL-Trp作為新相形成晶核并生長。
根據(jù)圖5所示旋光度-時間曲線變化可以看出,在水和甲醇混合溶劑中加熱后,反應體系溶液的旋光度先是負值增加。恒溫時旋光度變化很小,且在一定范圍內(nèi)波動。開始降溫后,溶液旋光度負值逐漸減小,最后穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)。
所以當溫度發(fā)生改變時,L-Trp發(fā)生了構型變化。L-Trp溶液體系旋光度由負值變?yōu)榱惚砻鳎琇Trp構型變化過程是一個漸變過程,該過程與DLTrp結晶的成核和晶體形成過程是一致的,由此推斷超分子外消旋體DL-Trp的自組裝過程很可能是一個碳酸釹參與下的協(xié)同反應過程。
L-Trp在碳酸釹的催化下形成DL-Trp過程在降溫階段,尤其降至90℃左右時,部分L-Trp加速轉化為D-Trp,最終降至室溫達到平衡,通過成核結晶生成 LD-Trp。
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