王 建，唐麗娟，2，劉瑋煒，馬衛(wèi)興，陳 龍

(1.淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，江蘇 連云港 222005;2.中國礦業(yè)大學(xué)，江蘇 徐州 221116)

1875年Kuhne認(rèn)為源自生物中一種呈色物質(zhì)含有吲哚核。1892年Neumeister定名為色氨酸。1907年Ellinger提出色氨酸的結(jié)構(gòu)式，F(xiàn)lamand用化學(xué)合成法加以確定。色氨酸以游離或結(jié)合態(tài)廣泛存在于生物中。L－色氨酸呈白色或略帶黃色的葉片狀結(jié)晶或粉末，在稀酸或稀堿中溶解。它與酸在暗處加熱或在堿液中都較穩(wěn)定，但存在其他氨基酸或糖類時則易分解，與水共熱則產(chǎn)生少量吲哚。L－色氨酸如在NaOH、CuSO4存在下加熱，則產(chǎn)生大量吲哚［1］。目前，國內(nèi)外有關(guān)D－色氨酸的研究報告仍較少［2－4］。

獲得高質(zhì)量色氨酸單晶體的難度很大，至今在劍橋晶體數(shù)據(jù)庫中收錄的幾個結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)都是DLTrp的。如Erik Bye等［5］1973年通過 X－射線衍射法測定 DL－Trp 甲酸鹽晶體結(jié)構(gòu)。Bakke等［6］1980年將DL－Trp溶于熱吡啶冷卻后得到的 DL－Trp晶體，將DL－Trp溶于熱草酸水溶液，經(jīng)緩慢冷卻制得 D－Trp草酸氫鹽晶體。Christian B 等［7］報道 LTrp甲酸溶劑化物晶體在183 K下測定的結(jié)構(gòu)。Hübschle CB 等［8］通過將 DL－Trp 溶于溫?zé)岬漠惐迹姿犸柡腿芤壕徛鋮s得到晶體并在173 K下測定結(jié)構(gòu)。本文作者原打算以L－Trp和碳酸釹為原料，通過混合溶劑熱法制得L－Trp和釹的配合物，卻意外地得到高產(chǎn)率的DL－Trp單晶體。在反應(yīng)體系中，Trp分解現(xiàn)象遠(yuǎn)少于一般過渡金屬離子與Trp的反應(yīng)。經(jīng)單晶X衍射分析對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確定，還進(jìn)行了紅外表征和分析，并運(yùn)用旋光度測定方法研究了構(gòu)型的轉(zhuǎn)變過程。該發(fā)現(xiàn)對開發(fā)和應(yīng)用新型穩(wěn)定的氨基酸類藥物釋放載體結(jié)晶材料具有重要價值［9］。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

傅立葉變換紅外光譜儀，B型，美國 PE;Bruker SMART 1000 CCD單晶衍射儀。L－Trp為生化試劑 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，碳酸釹為化學(xué)純 (連云港麗港稀土有限公司)，無水甲醇為分析純。所有試劑使用前未經(jīng)進(jìn)一步處理。25 mL壓力釜 (上海羌強(qiáng)實業(yè)發(fā)展有限公司)。101A－2數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱 (上海浦東欣悅科學(xué)儀器廠)。

1.2 實驗過程

1.2.1 LD－Trp 的制備 稱取 L－Trp(圖 1)0.406 4 g(2.0 mmol)，加入體積比為1∶1的去離子水和甲醇混合溶劑15 mL，不斷攪拌使之完全溶解，形成透明溶液。將0.235 0 g(0.5 mmol)碳酸釹倒入上述溶液中，攪拌均勻。將混合液轉(zhuǎn)入25 mL容量的特氟隆內(nèi)膽，用不銹鋼壓力釜密封。置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中，升溫至150℃，保溫72 h后，緩慢以2℃/h降至100℃，再以5℃/h降至室溫(30℃)。得到圖2所示淺棕黃色長片狀晶體，產(chǎn)率97.12%。產(chǎn)物在熔點(diǎn)前分解，熔點(diǎn)低于L－Trp(280～285℃)。該晶體不溶甲醇、乙醇、DMF和DMSO。

1.2.2 紅外光譜 DL－Trp單晶的 IR(KBr壓片)如圖3所示。

圖3 DL－Trp的紅外光譜Fig.3 FTIR spectrum of DL－Trp

1.2.3 DL－Trp的晶體結(jié)構(gòu)測定 選取尺寸大小為0.17 mm ×0.15 mm ×0.03 mm 的單晶體置于單晶衍射儀上，在298(2)K下，用經(jīng)石墨單色器單色化的 MoKα射線 (λ =0.071 073 nm)，以 φ－ω 掃描方式收集衍射數(shù)據(jù)。在2.20°≤θ≤25.01°范圍內(nèi)收集到4 751個衍射點(diǎn)，其中獨(dú)立衍射點(diǎn)1 720個(Rint=0.167 8)，I＞2σ (I)的可觀測點(diǎn)746個?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)采用SHELXS－97程序由直接法解出。對非氫原子坐標(biāo)及其各向異性溫度因子進(jìn)行全矩陣最小二乘法精修，所有計算在PC機(jī)上用SHELXL－97程序包完成。其它相關(guān)晶體學(xué)數(shù)據(jù)列于表1。

表1 DL－Trp的晶體學(xué)數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Crystallographic data of DL－Trp

產(chǎn)物的選擇鍵長和鍵角如表2所示。氫鍵參數(shù)如表2所示。

1.2.4 不定形L－Trp固體在混合溶劑熱條件下轉(zhuǎn)變?yōu)镈L－Trp單晶體過程的旋光度測定 稱取L－Trp 1.016 g(5.0 mmol)，加入體積比為1∶1 的去離子水和甲醇混合溶劑150 mL，攪拌使之溶解形成透明溶液，再加去離子水100 mL定容至250 mL。將0.235 0 g(0.5 mmol)碳酸釹倒入上述溶液中，攪勻。將混合液分成10組轉(zhuǎn)入25 mL容量的特氟隆內(nèi)膽，用不銹鋼壓力釜密封。置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中，升溫至150℃，保溫72 h(期間每隔24 h取出一組測旋光度)，緩慢以2℃/h降溫，每降30℃取出一組測旋光度，降到30℃為止。所得溶液為淺棕黃色，經(jīng)離心后取清液進(jìn)行旋光度的測定。觀測旋光度隨時間的變化情況如圖4所示。

圖4 兩次測定L－Trp構(gòu)型轉(zhuǎn)變過程旋光度－時間曲線的對比Fig.4 Curves of optical rotation α and reaction time of L－Trp configuration transforming by twice measurement

將圖4所示L－Trp在碳酸釹存在下構(gòu)型變化過程中兩次重復(fù)測定體系旋光度α/(°)隨時間t/h的變化曲線進(jìn)行對比，可發(fā)現(xiàn)體系旋光度開始均為負(fù)值，隨時間變化，負(fù)值趨小，最后接近為零(水的旋光度)。

2 結(jié)果與討論

2.1 L－Trp 和 DL－Trp 的紅外光譜

比較L－Trp和圖3的DL－Trp紅外光譜，主要相關(guān)吸收峰的變化由表3顯示。由于分子中有，出現(xiàn)3 403 cm－1N－H伸縮吸收峰，3 030～2 060 cm－1間的的3個峰分別歸屬于苯環(huán)上C－H鍵的特征吸收，其中主要峰從3 038(S)→3 045(S)，波數(shù)略增。羧基中強(qiáng)的C=O吸收從1 667→1 663 cm－1，波數(shù)略減。1 591(S)cm－1峰則裂分為1 584(S)和1 610(S)cm－1雙峰，1 414(m)cm－1峰未變化，分別歸屬于面內(nèi)彎曲和。739 cm－1歸屬于吲哚氮的振動吸收峰，與L－Trp的744 cm－1相比有所減小，但吲哚氮未明顯參與氫鍵作用。

2.2 分子結(jié)構(gòu)

表2 DL－Trp的鍵長和鍵角Table 2 Bond lengths and angles of DL－Trp

表3 DL－Trp和 L－Trp的紅外光譜比較Table 3 FTIR analysis of DL－Trp and L－Trp

2.3 轉(zhuǎn)變機(jī)理

為了證明形成DL－Trp型單晶過程中D－Trp是由部分L－Trp轉(zhuǎn)型而來，作者專門對生產(chǎn)廠商的LTrp試劑產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行了核實，并測定了試劑LTrp的比旋光度。結(jié)果表明DL－Trp中D－Trp確由部分L－Trp轉(zhuǎn)型而來。有趣的是L－Trp在一般條件下不穩(wěn)定易分解，而在碳酸釹存在下形成單晶時，不僅發(fā)生部分轉(zhuǎn)型，而且依賴NH3+和COO－間的N－H…O氫鍵締合作用與D－Trp一起形成很穩(wěn)定的單晶體。由于量化計算的軟硬件條件和技術(shù)水平的限制，作者未能對L－Trp與D－Trp形成相應(yīng)的單晶體結(jié)構(gòu)作理論計算。對于L－Trp轉(zhuǎn)型的原因，雖然LTrp與其他氨基酸相比并不易發(fā)生消旋化，但與pH及溫度呈現(xiàn)正相關(guān)性。有關(guān)L－氨基酸在熱堿及高溫、高壓和一定時間等條件作用下發(fā)生異構(gòu)化或消旋化的研究，并從各種L－氨基酸結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來探索其變化的規(guī)律性曾有報道［10－15］。L－Trp 的雜環(huán)基團(tuán)為吲哚基，由于亞甲基與吡咯環(huán)產(chǎn)生σ－π超共軛效應(yīng)，使β－C原子電子向吡咯環(huán)轉(zhuǎn)移。吡咯環(huán)氮原子上孤對電子可與苯環(huán)產(chǎn)生p－π共軛效應(yīng)，而使電子進(jìn)一步向苯環(huán)分散。這兩個共軛效應(yīng)使α－C電子密度大為降低，共振為烯胺構(gòu)型的量也降到最少。

作者認(rèn)為在Trp與過渡金屬離子M2+形成配位聚合物或在碳酸釹存在下形成DL－Trp單晶體時，L－Trp為了滿足晶體結(jié)構(gòu)對稱性的需要，在溶液的pH值 (弱堿性)及溶劑效應(yīng) (超臨界)的影響下，克服空間位阻效應(yīng)，使一定量的L－Trp改變其構(gòu)型形成D－Trp。這一點(diǎn)也被目前所獲得的部分實驗事實所證實［16－21］:即通過水熱及有機(jī)溶劑熱法只能得到 ［M(D－Trp)(L－Trp)］n型聚合物，而無法得到 ［M(L－Trp)2］n或 ［M(D－Trp)2］n型聚合物。而且目前色氨酸的單晶體也只能得到外消旋體 DL－Trp。

在水熱條件下，適合的過渡金屬離子作為模板劑，可使部分L－Trp通過先形成烯胺構(gòu)型再逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镈－Trp。在L－Trp和D－Trp之間存在轉(zhuǎn)換平衡，通過結(jié)晶和從溶液體系析出方式使該平衡發(fā)生移動，因此有利于低能量構(gòu)型的配位聚合物和外消旋體DL－Trp作為新相形成晶核并生長。

2.4 L－Trp轉(zhuǎn)變?yōu)?DL－Trp的過程中旋光度的變化

根據(jù)圖5所示旋光度－時間曲線變化可以看出，在水和甲醇混合溶劑中加熱后，反應(yīng)體系溶液的旋光度先是負(fù)值增加。恒溫時旋光度變化很小，且在一定范圍內(nèi)波動。開始降溫后，溶液旋光度負(fù)值逐漸減小，最后穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)。

所以當(dāng)溫度發(fā)生改變時，L－Trp發(fā)生了構(gòu)型變化。L－Trp溶液體系旋光度由負(fù)值變?yōu)榱惚砻?，LTrp構(gòu)型變化過程是一個漸變過程，該過程與DLTrp結(jié)晶的成核和晶體形成過程是一致的，由此推斷超分子外消旋體DL－Trp的自組裝過程很可能是一個碳酸釹參與下的協(xié)同反應(yīng)過程。

L－Trp在碳酸釹的催化下形成DL－Trp過程在降溫階段，尤其降至90℃左右時，部分L－Trp加速轉(zhuǎn)化為D－Trp，最終降至室溫達(dá)到平衡，通過成核結(jié)晶生成 LD－Trp。

［1］宋文霞，王瑞明.L－色氨酸的研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2005(3):18－20.

［2］吳妙宗，蔡輝益.色氨酸營養(yǎng)代謝研究進(jìn)展［J］.蓄禽業(yè)，2001(11):47－49.

［3］王大慧，韋萍，歐陽平凱.D－色氨酸研究進(jìn)展［J］.化工進(jìn)展，2002(2):103－105.

［4］李劍欣，張緒梅，徐琪壽.色氨酸的生理生化作用及其應(yīng)用［J］.氨基酸和生物資源，2005(3):58－62.

［5］ERIK B，ARVID M，CHRISTIAN R.Crystal structure of DL－tryptophan formate［J］.Acta Chemica Scandinavica，1973(27):471－484.

［6］BAKKE ?，MOSTAD A.The structure and conformation of tryptophan in the crystal of the pure racemic compound and the hydrogen oxalate［J］.Acta Chem Scand:B，1980，34:559－570.

［7］CHRISTIAN B H，BIRGER D，PETER L.L－Tryptophan formic acid solvate at 183 K［J］.Acta Crystallographica Section C，2002，C58，o540－o542.

［8］HüBSCHLE C B，MESSERSCHMIDT M，LUGER P.Crystal structure of DL－Tryptophan at 173 K cryst［J］.Res Technol，2004，39:274 －278.

［9］黃岳山，趙修華，吳效明，等.氨基酸類聚合物材料及其在藥物控釋系統(tǒng)中的應(yīng)用［J］.中國醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志，2003(1):39－42.

［10］馮淑華.L－氨基酸消旋化的結(jié)構(gòu)理論探討［J］.安徽師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2000，23(2):149－157.

［11］劉志皋.食品營養(yǎng)學(xué)［M］.北京:輕工業(yè)出版社，1991.

［12］袁纓，張旭東.飼料中氨基酸異構(gòu)體的測定方法及氨基酸異構(gòu)化研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，34(4):439－444.

［13］PALLA G，MARCHELLI R，DOSSENA A，et al.Occurrence of D－amino acids in food:Detection by capillary gas chromatography and by reversed－phase high－performance liquid chromatography with L－phenylalaninamides as chiral selectors［J］.Journal of Chromatography，1989，475:45 －53.

［14］BRUECKNER H，JACK P，LANGER M，et al.Liquid chromatographic determination ofD－aminoacidsin cheese and cow milk.Implication of starter cultures，amino acid racemases，and rumen microorganisms on formation，and nutritional considerations［J］. Amino acids，1992，2:271 －284.

［15］FRIEDMAN M，GUMBMANN R，BOCA R FA.Absorption and utilization of amino acids［J］.CRC Press，1989，2:173－190.

［16］王建，許興友，馬衛(wèi)興，等.氨基酸配位聚合物［Co(LTrp)(D－Trp)］n［J］.無機(jī)化學(xué)學(xué)報，2008，24(9):1514－1918.

［17］WANG J，XU X Y，MA W X，et al.Synthesis and Structure of a two－dimensional double chain iron(Ⅱ)L－Trp coordination polymer［Fe(L－Trp)2(HL－Trp)2］n［J］.Chin J Struc Chem，2008，27(2):153－158.

［18］王建，許興友，馬衛(wèi)興，等.混合溶劑熱法制備［Zn(L－Trp)(D－Trp)］n［J］.人工晶體學(xué)報，2008，37(5):1199－1204.

［19］XIE Y，WU H H，YONG G P，et al.rac－Poly ［bis－(μ－tryptophanato)manganese(II)］［J］.Acta Cryst E，2006，62:m2089－m2090.

［20］WANG J，XU X Y，MA W X，et al.rac－catena－Poly［nickel(II)－di－μ－tryptophanato］［J］.Acta Cryst E，2007，63:m2867－m2868.

［21］WANG J，XU X Y，MA W X，et al.An Interesting Complex:［Cd(L－Trp)(D－Trp)］n［J］.J Ino ＆Organometallic Polymers＆ Materials，2009，19(3):53－58.