余 倩

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院，廣東 廣州 510225;2.中山大學 有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東 廣州 510275)

1972年Kerr等人［1］首次提出細胞凋亡的概念，即在一定的生理或病理條件下，細胞受內(nèi)在遺傳機制控制，自動結(jié)束生命的過程。細胞凋亡有明顯形態(tài)學和生化學的特征，形態(tài)學特征包括:細胞核濃縮和片段化，胞質(zhì)濃縮、細胞體急劇變小，細胞骨架解體，且常伴隨有細胞質(zhì)膜出泡現(xiàn)象［2］。生化學特征包括:染色質(zhì)片段化，形成長度180～200 bp整數(shù)倍的寡聚核苷酸片段，瓊脂糖凝膠電泳時呈現(xiàn)“梯狀”條帶 (DNA ladder)。

在多細胞生物體中，細胞凋亡作為一種抗病毒應答機制能限制入侵細胞中的病毒，從而減少子代病毒的產(chǎn)生，及造成流產(chǎn)性感染［3－5］。目前已發(fā)現(xiàn)多種桿狀病毒可誘導昆蟲離體細胞凋亡，如野生型苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒誘導?；页嵋苟闟.littoralis細胞 SL2 凋亡等［6］。

斜紋夜蛾 (Spodoptera litura，Splt)和甜菜夜蛾 (Spodoptera exigua，Se)同屬夜蛾科灰翅夜蛾屬的昆蟲，親緣關系很近，且斜紋夜蛾核多角體病毒 (Splt nucleopolyhedrovirus，SpltMNPV和SeMNPV基因組相似性很高［7－8］，但這兩種病毒不能交叉感染各自宿主。SeMNPV感染SpLi-221會引起細胞凋亡［9］，而SpltMNPV感染Se301的研究還未見報導。本文在顯微水平和亞顯微水平上對SpltMNPV感染離體細胞Se301的過程進行了描述，并對感染失敗原因進行了初步分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 昆蟲細胞與病毒 野生型SpltMNPV中山大學分離株由本實驗室保存。SeMNPV－SeUS1引自美國加州大學Riverside分校B.A.Federici教授實驗室。甜菜夜蛾細胞Se301由荷蘭Wageningen大學J.M.Vlak教授惠贈，用φ=10%胎牛血清的Grace's培養(yǎng)基(Invitrogen)27℃培養(yǎng)。

1.1.2 供試昆蟲 斜紋夜蛾、甜菜夜蛾幼蟲由本實驗室養(yǎng)蟲室提供，為人工飼料飼養(yǎng)的健康幼蟲。人工飼料配方見參考資料［10］，飼養(yǎng)溫度27～28℃。

1.1.3 試劑 DAPI(4'，6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)購自Roche公司;細胞總DNA提取試劑盒購自Takara。

1.2 方法

1.2.1 病毒多角體擴增 將病毒多角體涂布于人工飼料表面喂飼四齡初昆蟲幼蟲，感染4～5 d后收集呈現(xiàn)典型病毒感染癥狀的幼蟲 (蟲體倒掛，身體腫脹，呈灰白色)，置室溫下靜置2～3 d讓其自然發(fā)酵。用10倍的PBS懸浮發(fā)酵的蟲尸，經(jīng)4層紗布過濾，濾液經(jīng)3 000 r/min離心10 min，沉淀物重懸于適量PBS中，600 r/min離心5 min，收集上清。如此重復3～4次，直至多角體懸浮液呈乳白色，光學顯微鏡檢查在多角體懸液中雜質(zhì)很少，即為較純的病毒多角體。

1.2.2 病蟲血淋巴制備 用多角體喂飼四齡初幼蟲，感染3 d后經(jīng)鏡檢有極少量多角體出現(xiàn)即取血淋巴。用φ=70%乙醇將病蟲表面消毒，剪開腹足，血淋巴滴入含w=0.1%苯基硫脲的Grace's培養(yǎng)基中，3 000 r/min離心10 min，除去血淋巴細胞，取上清經(jīng)過濾滅菌保存，供細胞感染用。

1.2.3 病毒感染 在35 mm培養(yǎng)皿中以0.5×106個細胞/孔密度接種對數(shù)生長期的Se301細胞;待細胞貼壁1 h后，移出培養(yǎng)基，病毒以MOI為1感染細胞，27℃培養(yǎng)1 h并間隔搖動培養(yǎng)板;1 h后棄感染液，以無抗生素無血清Grace's培養(yǎng)基洗2次，然后加入Grace's培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。加入病毒即開始計時，于感染后不同時間收集取樣，3 000 r/min離心10 min，棄上清，細胞沉淀先放入液氮速凍30 min，再放入－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 病毒滴度測定 采用終點稀釋法對病毒進行定量測定［10］，具體步驟參考 O'REILLY主編的《桿狀病毒表達載體》。

1.2.5 電鏡樣品制備及觀察 用病毒SeMNPV和SpltMNPV以MOI=1分別感染Se301細胞，于感染后0、24、48、72、96和120 h用細胞刮收集細胞，2 500 r/min離心5 min收集細胞。按常規(guī)電鏡樣品制備方法制備，簡述包括前固定、漂洗、后固定、脫水、浸透、包埋、聚合、切片、染色步驟。鏡檢:用JEM－100CX型電鏡在加速電壓80 KV下觀察。

1.2.6 DAPI染色 將固體粉末用雙蒸水稀釋成終質(zhì)量濃度1～5 mg/mL作為儲存液;用甲醇稀釋儲存液至終質(zhì)量濃度1 μg/mL作為工作液。具體操作步驟參見Roche公司產(chǎn)品說明書。使用340 nm/380 nm濾片進行熒光顯微鏡觀察。

1.2.7 細胞總DNA的提取 按照Merck公司的細胞總DNA提取試劑盒 (Suicide TrackTMDNA Ladder Isolation Kit)操作手冊進行。

2 結(jié)果

2.1 SpltMNPV感染Se301細胞的光學顯微鏡觀察SpltMNPV按照MOI=1的感染復數(shù)感染Se301

細胞，感染后每天用光學顯微鏡進行細胞觀察。正常Se301細胞形態(tài)為長形梭狀 (圖1a);SeMNPV感染Se301細胞后細胞出現(xiàn)典型的感染癥狀，如細胞變圓;后期細胞中能觀察到大量多角體 (圖1b)。SpltMNPV感染Se301細胞光鏡觀察結(jié)果顯示在感染后24～120 h期間細胞出現(xiàn)明顯病理現(xiàn)象，且隨著時間的延長病理癥狀越來越嚴重，在24～48 h時出現(xiàn)極少量凋亡小體，大部分細胞出現(xiàn)感染癥狀，如細胞變圓變大;也可觀察到空泡細胞和少量細胞聚集 (圖1c)，到96～120 h時出現(xiàn)大量細胞聚集，空泡細胞明顯增多，但始終觀察不到病毒多角體 (圖1d)。

2.2 SpltMNPV感染Se301細胞的電子顯微鏡觀察

圖1 病毒感染的Se301細胞光鏡照片F(xiàn)ig.1 Light micrographs of Se301 cells infected

圖2 SpltMNPV感染的Se301細胞電鏡照片F(xiàn)ig.2 Electron micrographs analysis of Se301 cells infected with SpltMNPV

光鏡觀察顯示感染細胞除產(chǎn)生少量凋亡小體外大部分細胞出現(xiàn)空泡和細胞聚集現(xiàn)象，為了更清楚準確的觀察細胞內(nèi)發(fā)生了什么病理變化，這些空泡細胞內(nèi)到底有沒有DNA存在，融合在一起的細胞是什么狀態(tài)，我們收取SpltMNPV感染Se301細胞后24，48，72，96，120 h樣品進行電鏡觀察，結(jié)果如圖2顯示:正常Se301細胞成單個長橢圓形，具有完整細胞器、細胞膜和核膜;細胞質(zhì)和染色質(zhì)分布均勻 (圖2:a)。SeMNPV感染Se301細胞72 h整個細胞變成圓形，細胞質(zhì)均勻分布，但細胞核膨大，病毒在核中央形成了病毒發(fā)生基質(zhì)，再放大數(shù)倍后可觀察到細胞核內(nèi)有許多正在包裝和已經(jīng)包裝好的病毒粒子 (圖2:b，c)。SpltMNPV感染Se301細胞電鏡觀察顯示:從感染后24～120 h均能觀察到細胞病理現(xiàn)象，且晚期更劇烈。有些細胞只能看見細胞核膜包裹著高度凝聚的染色質(zhì)，觀察不到細胞膜和細胞質(zhì)，在兩個細胞間無清晰界限只有許多空泡存在;有一些細胞變圓細胞核膜完整且細胞核完好但細胞質(zhì)中出現(xiàn)許多空泡;有一些細胞細胞質(zhì)完全被泡狀化且細胞核內(nèi)染色質(zhì)被高度濃縮凝聚并附于核膜周邊 (圖2:d，e，f);以上結(jié)果可被判斷細胞出現(xiàn)了早期凋亡癥狀，但始終沒有進行至細胞凋亡晚期出現(xiàn)凋亡小體。

2.3 DAPI染色

電鏡結(jié)果表明細胞出現(xiàn)早期凋亡特征，為了更直觀地觀察細胞 DNA的變化，我們用 DAPI對SpltMNPV感染Se301細胞進行染色。DAPI是一種能與DNA強力結(jié)合的熒光染料﹐常被用于凋亡的檢測;DAPI染劑能被紫外光激發(fā)，在熒光顯微鏡下觀察為藍色。

熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖3所示:正常Se301細胞由于細胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，DAPI染色后細胞核呈現(xiàn)為明亮而均勻的圓形 (圖3:a);而被感染的Se301細胞從感染后24～120 h有明顯變化(圖3:b，c，d)，例如有些細胞染色質(zhì)分布不均，高度凝聚成不規(guī)則形狀如月牙形，并集中在細胞核邊緣;有些細胞細胞核染色熒光強度很弱，形狀也不規(guī)則;還有些細胞中的DNA已經(jīng)斷裂，染色后呈現(xiàn)為許多個熒光小點并集中在核邊緣上，細胞至感染后期也無太大改變并未見有大量凋亡小體產(chǎn)生。以上結(jié)果說明細胞出現(xiàn)了早期凋亡現(xiàn)象，而未進行至晚期，這些結(jié)果與電鏡觀察結(jié)果一致。

圖3 DAPI染色的Se301細胞熒光顯微鏡觀察Fig.3 Micrographes of Se301 Stained by DAPI

2.4 DNA ladder

細胞凋亡的另一個特征是出現(xiàn)DNA ladder現(xiàn)象，這屬于凋亡晚期事件但比極晚期事件出現(xiàn)凋亡小體早。為了鑒定細胞凋亡進程是否進行至DNA ladder階段，收取 SpltMNPV感染 Se301細胞24，48和72 h的細胞樣品，提取其細胞總DNA進行電泳。實驗結(jié)果如圖4顯示:SpltMNPV感染Se301細胞24，48和72 h樣品與正常Se301細胞及SeMNPV感染Se301細胞72 h樣品一樣都沒有出現(xiàn)典型梯度條帶。這些結(jié)果說明SpltMNPV感染Se301細胞從24～72 h都未進行至DNA梯度條帶的凋亡晚期階段。

圖4 Se301細胞總DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.4 Agarose gel electrophoresis of oligonucleosomal laddering isolated from Se301 cells

2.5 一步生長曲線測定

光鏡檢測一直未觀察到SpltMNPV感染Se301細胞中有多角體產(chǎn)生，說明細胞的早期凋亡對病毒感染以及子代病毒產(chǎn)生具有嚴重影響。進行TCID50一步生長曲線測定檢測病毒是否產(chǎn)生了BV。收取SpltMNPV感染Se301細胞24，48，72，96，120 h的細胞上清，同時也收取相應時間的SpltMNPV感染SpLi-221細胞作為陽性對照，用SpLi-221細胞測定SpltMNPV滴度。結(jié)果顯示:SpltMNPV感染SpLi221細胞后病毒產(chǎn)生了大量有感染性的子代病毒，且感染后72 h達到最大值;而SpltMNPV感染Se301細胞樣品中檢測不到有感染性的BV產(chǎn)生。

圖5 SpltMNPV感染SpLi－221或Se301細胞的BV增長曲線Fig.5 The BV replicative curves generated from an infection of SpltMNPV in Se301 or SpLi-221 cells

3 討論

本研究通過光學顯微鏡和電子顯微鏡對SpltMNPV感染非受納細胞Se301進行形態(tài)觀察，以及DAPI染色等檢測，首次發(fā)現(xiàn)被SpltMNPV感染的Se301細胞發(fā)生了早期凋亡但未能進行至晚期凋亡出現(xiàn)凋亡小體，本結(jié)果又一次證明了細胞凋亡是宿主抵抗病毒感染的防御機制，具有普遍的生物學意義。先前已有關于桿狀病毒誘導離體細胞凋亡的報道:如野生型AcMNPV感染的SL2［6］，美國白蛾核多角體病毒 (HyphantriacuneaNPV，HycuNPV)感染的Ld652Y細胞［11］，但這些研究中細胞凋亡都進行至凋亡晚期即形成凋亡小體。桿狀病毒誘導早期細胞凋亡是否影響病毒復制周期的完成至今還少有報道，本研究發(fā)現(xiàn)正是由于Se301發(fā)生了早期細胞凋亡從而阻止SpltMNPV產(chǎn)生BV和ODV子代病毒，可稱Se301細胞為SpltMNPV的非受納細胞。

對于任何一種病毒來說它進入宿主細胞和組織的能力和它在里面復制并釋放有感染活性病毒的能力決定著這種病毒的宿主范圍。SpltMNPV感染Se301細胞后在早期24 h時有極少數(shù)細胞產(chǎn)生凋亡小體，推測可能是病毒BV在病毒表面的糖蛋白GP64或其同源蛋白LD130參與下通過包內(nèi)吞作用進入細胞后［12］，其早期事件如早期基因的表達誘導了細胞凋亡。有研究已證實桿狀病毒誘導的細胞凋亡可由感染早期事件所引起［13］。ie1是病毒感染的極早期基因，先前研究表明它能引起由AcMNPV誘導的Sf21細胞凋亡［14］。

被SpltMNPV感染的Se301細胞絕大部分只出現(xiàn)了早期凋亡并停滯在這個階段，沒有進行至晚期出現(xiàn)凋亡小體。推測病毒進入細胞后雖然病毒的早期事件引起了細胞凋亡的開啟，可能病毒的抗凋亡基因Splt-iap4或Splt-p49得到了表達且具有抗凋亡功能，從而阻止了細胞凋亡的進程。早期基因表達后病毒借此機會進行了自身的復制和轉(zhuǎn)錄，DNA復制后病毒隨即進行晚期或極晚期基因表達［15］，由于某種未知原因，病毒晚期基因的表達可能受到抑制以至病毒不能完成BV的裝配和產(chǎn)生子代病毒，所以在實驗中我們觀察到了以上的現(xiàn)象。

根據(jù)凋亡形態(tài)學的特征，本研究中的現(xiàn)象除一些與早期凋亡一致外，還有一些與凋亡特征不符，如細胞聚集融合在一起。由于受死亡信號刺激，典型的凋亡早期細胞應出現(xiàn)細胞膜卷曲皺縮，表面微絨毛消失，連接消失，與周圍的細胞脫離等癥狀，而所觀察到的現(xiàn)象卻是幾個細胞簇集在一起分不清細胞邊界。實驗中我們注意到，Se301細胞被SeMNPV感染后早期會出現(xiàn)細胞聚集現(xiàn)象，病毒產(chǎn)生子代病毒后又慢慢自行分開，所以推測以上現(xiàn)象為早期凋亡和病毒感染細胞雙重影響的結(jié)果。

致謝本研究在中山大學龐義教授和楊凱教授的指導和幫助下完成，謹以感謝。

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