陳勝華，王文武，向 娟

(1．中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長(zhǎng)沙410083;2．中州大學(xué)化工食品學(xué)院，鄭州450044)

1． 緒論

腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是腫瘤普查、診斷和預(yù)后的主要技術(shù)手段之一。前列腺癌腫瘤標(biāo)志物前列腺特異性抗原(prostate－specific antigen，PSA)是前列腺癌診斷的標(biāo)志物，對(duì)其檢測(cè)可以有效的檢測(cè)和預(yù)防前列腺癌的發(fā)生［1－2］。PSA 又可以分為 f－PSA 和PSA －ACT［3］，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)檢測(cè) f－ PSA，并且比較 f－PSA/t－PSA的比值可以有效的區(qū)分前列腺增生和前列腺癌，特別是在診斷灰色區(qū)(PSA濃度在4－10 ng/mL)，可以有效地提高診斷真實(shí)性，降低誤診率。表面等離子體激元共振(surface plasmon resonance，SPR)技術(shù)［4］是一種基于芯片表面折射率變化的光學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具有快速、靈敏、免標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)時(shí)在線地跟蹤固液界面反應(yīng)，在蛋白及核酸等生物分子檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。但是，傳統(tǒng)的SPR檢測(cè)方法難以檢測(cè)低分子量、超低濃度的生物分子。f－PSA在人血清中的濃度非常低，直接利用傳統(tǒng)的SPR技術(shù)很難檢測(cè)。而納米金具有密度大、介電常數(shù)大、良好的生物相容性，可以極大的增強(qiáng)SPR信號(hào)［5－6］。因此，我們結(jié)合兩者的優(yōu)點(diǎn)，設(shè)計(jì)出基于納米金放大的SPR技術(shù)檢測(cè)f－PSA，這種方法既可保持生物分子的生物活性，又可有效突破傳統(tǒng)SPR的限制。

2． 實(shí)驗(yàn)部分

2．1 試劑

實(shí)驗(yàn)所用的載液為磷酸緩沖液(PBS，15 mmol/L，pH=7．4 包含0．85%NaCl)，使用前用0．22 － μm的膜過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，且避光存于冰箱內(nèi)待用。11－巰基十一酸(MUA)溶解純酒精中(10 mmol/L);羧基活化劑 NHS(0．1 mol/L)和 EDC(0．4 mol/L)、氨基乙醇(AE 1 mol/L)、游離前列腺特異性抗體(anti－f－PSA)、均溶解在PBS緩沖液中。游離前列腺特異性抗原(f－PSA)溶解在醋酸鈉緩沖液(10 mmol/L，pH=5．6 包含 0．85%NaCl)。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。所有溶液均用18．0 M·cm的超純水配置。

2．2 儀器

實(shí)驗(yàn)采用由美國(guó)BI公司研制的BI－3000 SPR雙通道檢測(cè)系統(tǒng)，配備有美國(guó)Kent Scientific公司的流動(dòng)注射泵(型號(hào)Genie Plus)，構(gòu)建成流動(dòng)注射表面等離子體激元共振 (FI－SPR)裝置。此裝置含六個(gè)流通閥，流通池的進(jìn)樣端與六通閥的一端相連，六通閥上進(jìn)樣環(huán)的體積為200 μl。實(shí)驗(yàn)時(shí)用注射器將載液注入注射泵上，在流動(dòng)注射泵的推動(dòng)下，載液流經(jīng)六通閥后流過(guò)流通池，如果進(jìn)樣環(huán)中注入了檢測(cè)樣品，載液將會(huì)把樣品帶入流通池進(jìn)行分析檢測(cè)，計(jì)算機(jī)將實(shí)時(shí)的記錄時(shí)間與角度變化感應(yīng)圖。

2．3 SPR 芯片制備

將BK7蓋玻片先用水虎魚(雙氧水:濃硫酸=3:7，體積比)在80°C條件下煮約30分鐘，隨后用二次去離子水清洗干凈玻片上的濃硫酸，放置氨水中(水∶濃氨水∶雙氧水 =5∶1∶1，體積比)，超聲 20分鐘，然后用二次去離子水沖洗干凈，N2吹干。處理干凈后的玻片放到真空磁控濺噴鍍膜機(jī)(Sputter Coater 108auto/SE，Kert J．Lester Inc．，Clariton，PA)上進(jìn)行噴鍍，先在玻片的表面鍍一層2 nm厚的鉻，隨后在玻片表面鍍一層50nm左右的金［101］，通常鍍鉻的時(shí)候，選用的時(shí)間是295s，鍍金選用的時(shí)間是295s。組裝修飾芯片前先可用氫火焰進(jìn)行退火，以除去金膜表面的雜質(zhì)和附著物，或者將金膜用水虎魚快速清洗，去除金膜表面雜質(zhì)。首先需將處理干凈的金膜在浸泡10 mmol/L11－巰基十一酸(MUA)水溶液中，在室溫下避光浸泡12小時(shí)，使其表面形成一層規(guī)則的巰基自組裝單分子層;依次用酒精溶液、二次水清洗金膜，氮?dú)獯蹈山鹉溆谩?/p>

2．4 納米金復(fù)合物制備

納米金采用一步法檸檬酸鈉還原制備。0．125 mg/ml f－PSA與納米金溶液混合于 pH 9的0．1 mol/L的K2CO3溶液中，振蕩4小時(shí)，然后再4℃下以9000r/min速度冷凍離心25 min。移去上層清液，以去除多余的未結(jié)合的蛋白，沉淀用pH 7．4的15 mmol/L的PBS稀釋。

3． 結(jié)果與討論

由于作為腫瘤標(biāo)志物的f－PSA的分子量?jī)H為30 kD，如果在傳感芯片上面直接檢測(cè)，當(dāng)檢測(cè)到低濃度，特別是納克級(jí)的水平時(shí)，SPR信號(hào)受到儀器的限制而難以獲得。本文采用納米金放大信號(hào)檢測(cè)f－PSA，其檢測(cè)原理見圖1。首先，在金膜表面通過(guò)特異性的免疫反應(yīng)形成anti－f－PSA－f－PSA或者Au－f－PSA復(fù)合物。芯片表面首先固定單分子層的anti－f－PSA，然后注射不同濃度的f－PSA，最后注射固定濃度的Au－f－PSA復(fù)合物與anti－f－PSA發(fā)生免疫反應(yīng)，芯片表面固定的f－PSA越少，anti－f－PSA裸露的位點(diǎn)越多，當(dāng)最后注入Au－f－PSA復(fù)合物后，與基底裸露的anti－f－PSA特異性免疫結(jié)合產(chǎn)生的SPR信號(hào)越大。顯然，競(jìng)爭(zhēng)型免疫模式在低濃度檢測(cè)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

圖1 競(jìng)爭(zhēng)型免疫反應(yīng)模式SPR檢測(cè)原理示意圖(為了清晰表示，圖中分子及納米金均未按實(shí)際比例給出)

圖2所示為競(jìng)爭(zhēng)型免疫模式檢測(cè)f－PSA的SPR響應(yīng)曲線圖。圖中虛線所示為沒有注射f－PSA的控制實(shí)驗(yàn)，Au－f－PSA復(fù)合物直接與基底的anti－f－PSA特異性結(jié)合，理論上產(chǎn)生最大的SPR信號(hào)，其信號(hào)變化為198 mDeg。圖中實(shí)線為此實(shí)驗(yàn)的一個(gè)主體實(shí)驗(yàn)，圖中檢測(cè)的f－PSA的濃度為5 g/mL，由此產(chǎn)生的SPR信號(hào)有108 mDeg變化，當(dāng)Au－f－PSA復(fù)合物注入后，其產(chǎn)生的信號(hào)僅為9 mDeg。這個(gè)時(shí)候可以認(rèn)為Au－f－PSA復(fù)合物基本上不與基底的anti－f－PSA作用。當(dāng)檢測(cè)的 f－PSA的濃度減小時(shí)，基底上將剩余抗原結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)Au－f－PSA復(fù)合物注入后便會(huì)與基底作用，產(chǎn)生信號(hào)。當(dāng)檢測(cè)的f－PSA濃度逐漸降低時(shí)，Au－f－PSA復(fù)合物產(chǎn)生的信號(hào)逐漸增多，最后基本上達(dá)到控制實(shí)驗(yàn)的198 mDeg．

圖2 競(jìng)爭(zhēng)型免疫模式檢測(cè)f－PSA的SPR響應(yīng)信號(hào)圖

對(duì)于濃度大于5 ng/ml的f－PSA，可以直接通過(guò)SPR檢測(cè)，SPR不需要納米金等的放大作用，直接可以檢測(cè)。并且在一定的濃度范圍內(nèi)(5 ng/ml～50 ng/ml)存在一定的線性關(guān)系。對(duì)低于5 ng/ml的f－PSA，直接利用SPR檢測(cè)，很難檢測(cè)到信號(hào)變化。f－PSA在人血清中的濃度一般較低，即便是患有前列腺癌的患者血清中濃度也有低于納克級(jí)每毫升的濃度，所以直接利用SPR檢測(cè)人血清中的f－PSA的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到診斷的目的，因此利用納米金復(fù)合物放大SPR檢測(cè)信號(hào)，從而降低f－PSA檢測(cè)的的檢測(cè)下限，達(dá)到診斷前列腺癌的目的。建立的競(jìng)爭(zhēng)型免疫反應(yīng)模式也是基于 anti－f－PSA/f－PSA和anti－f－PSA/Au－f－PSA之間的特異性作用。從圖3可以明顯的看出，其納米金復(fù)合物有明顯的放大作用，由于所采用的是競(jìng)爭(zhēng)結(jié)構(gòu)，所以當(dāng)濃度檢測(cè)的f－PSA濃度越低時(shí)，納米金的放大信號(hào)就越大。通過(guò)這種免疫競(jìng)爭(zhēng)法，觀察SPR共振角度變化，可以很容易的檢測(cè)出低濃度的f－PSA(0．05 ng/mL至5 ng/ml)。

圖3 競(jìng)爭(zhēng)型免疫模式檢測(cè)f－PSA，Au－f－PSA復(fù)合物的SPR信號(hào)與f－PSA濃度的關(guān)系曲線圖

從圖3可以看出，Au－f－PSA信號(hào)與f－PSA的濃度在整個(gè)檢測(cè)區(qū)域內(nèi)不成線性關(guān)系。假設(shè)anti－f－PSA與f－PSA的反應(yīng)遵從Langmuir吸附等溫式假定的準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)，通過(guò)吸附和解離平衡公式的推導(dǎo)得到以下公式:

式中Γf－PSA代表f－PSA在傳感表面的覆蓋度，也就是相當(dāng)于SPR角度偏移值，Cf－PSA代表f－PSA的濃度，Kf－PSA代表抗原抗體反應(yīng)平衡常數(shù)。當(dāng)Cf－PSA濃度極低時(shí)，即 Kf－PSACf－PSA? 1 時(shí)，則可以得到以下公式:

由于我們實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用的是競(jìng)爭(zhēng)模式檢測(cè)，所以，anti－f－PSA不僅與 f－PSA結(jié)合，剩余的結(jié)合位點(diǎn)還會(huì)與Au－f－PSA結(jié)合。根據(jù)Langmuir吸附等溫式，在反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)有:

式中，KAu為抗體與納米金蛋白復(fù)合物反應(yīng)平衡常數(shù)，ΓAu代表納米金復(fù)合物的表面覆蓋度，也表示的是納米金復(fù)合物的SPR角度偏移值。C0代表納米金復(fù)合物的濃度值。如公式(4)所示，當(dāng)C0的濃度極低時(shí)，即KAuC0?1時(shí)，那么可以得到以下的公式:

從公式(5)可以看出，當(dāng)f－PSA濃度極低時(shí)，納米金復(fù)合物的SPR角度偏移值與f－PSA的濃度是成線性關(guān)系的，而且是成反比例關(guān)系的。

圖4 Au－f－PSA復(fù)合物的SPR信號(hào)與f－PSA低濃度下的的關(guān)系曲線圖

圖4為低濃度(0 ～2．5 ng/ml)下，Au－f－PSA復(fù)合物的SPR信號(hào)與f－PSA低濃度下的的關(guān)系曲線圖。通過(guò)線性擬合發(fā)現(xiàn):當(dāng)f－PSA濃度范圍為(0．05 ng/ml～2．5 ng/ml)時(shí)，Au －f－PSA 與基底anti－f－PSA特異性作用所產(chǎn)生的SPR角度變化與所檢測(cè)的f－PSA濃度成良好的線性關(guān)系。其線性回歸方程為(Y= －35X+187，R2=0．98，其中 Y 代表SPR角度偏移值，X代表f－PSA濃度(ng/ml)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3．0)。這與我們理論推出來(lái)的結(jié)果一致，即在低濃度下存在一定的線性關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)中我們所達(dá)到的檢測(cè)下限為0．05 ng/ml，這個(gè)檢測(cè)水平已經(jīng)達(dá)到前列腺癌早期診斷的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

4． 結(jié)論

本文采用納米金放大SPR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了前列腺癌腫瘤標(biāo)志物f－PSA在線檢測(cè)。利用抗原－抗體特異性相互作用，設(shè)計(jì)了競(jìng)爭(zhēng)型檢測(cè)模式進(jìn)行超靈敏檢測(cè)。結(jié)果顯示:當(dāng)檢測(cè)f－PSA濃度越低時(shí)，Au－f－PSA復(fù)合物與基底anti－f－PSA結(jié)合產(chǎn)生的信號(hào)越大。當(dāng)檢測(cè)的濃度范圍為0．05 ng/ml至2．5 ng/ml時(shí)，Au－f－PSA所產(chǎn)生的SPR角度變化與所檢測(cè)的f－PSA濃度成良好的線性關(guān)系。此方法能夠檢測(cè)0．05 ng/ml的水平，已經(jīng)達(dá)到診斷前列腺癌早期診斷的標(biāo)準(zhǔn)。

［1］Schaller J，Akiyama K，Tsuda R，et al．Isolation，characterization and amino－acid sequence of y－seminoprotein，a glycoprotein from human seminal plasma Eur［J］．J．Biochem，1987，170:111 －120．

［2］趙洪，張琚，馮劍利．血清PSA水平與前列腺癌的檢測(cè)［J］．中華泌尿外科雜志，1998，19(10):638 －639．

［3］Sozen H O．PSA Isoforms in Prostate Cancer Detection［J］．European urology supplements，2006，5:495 －499．

［4］Liedberg B，Nylander C，Lundstrom I．Surface － Plasmon Resonance for Gas － Detection and Biosensing［J］．Sens．Actuators，1983，4:299 －304．

［5］Faulk W P，Taylor G M．An immunocolloid method for the electron microscope，Immunochemistry［J］．Immunochemistry，1971，8:1081 －1083．

［6］Sperling R A，Gil P R，Zhang F，et al．2008 Gold:Chemistry，Materials and Catalysis Issue［J］．Chemical Society Reviews，2008，37(9):1896 －1908．