劉俊，李霖，張曉燕

(揚(yáng)州職業(yè)大學(xué)，江蘇揚(yáng)州225009)

苯甲酸鈉(sodium benzoate，SB)又稱安息香酸鈉。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，SB被廣泛應(yīng)用于碳酸飲料、泡菜、醬油、食醋等食品中作為防腐劑。很多國家允許使用SB為食品防腐劑。過去曾認(rèn)為SB對人體無毒，但最近的研究表明其可造成人體組織器官或機(jī)能的損壞，人體過量攝取會發(fā)生損壞肝臟甚至致癌等癥狀[1]，所以研究不同濃度的SB對生物細(xì)胞的損傷具有一定的意義。此外，很多種農(nóng)藥，包括殺蟲劑、除草劑和滅菌劑屬于或懷疑是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)(EDC，endocrine disruptors chemicals)類物質(zhì)，用于牙科修復(fù)的物質(zhì)——雙酚A，食品工業(yè)用的一些抗氧化劑如t－丁羥基茴香醚，以及塑料如芐丁基鄰苯二甲酸酯和4-羥基-烷基苯酚也被列入外源雌激素[2]。食品防腐劑苯甲酸鈉是否具有環(huán)境內(nèi)分泌干擾物作用，目前尚無明確報道。

草履蟲為單細(xì)胞生物，在水體中運(yùn)動較快，能與周圍介質(zhì)充分接觸，與多細(xì)胞生物相比，對毒性的反應(yīng)更為靈敏，且宜采集、培養(yǎng)。用它來研究SB對細(xì)胞的毒害及環(huán)境雌激素作用是比較理想的實驗料[3]。本研究旨在通過苯甲酸鈉對草履蟲的急性和慢性毒性作用研究，探索苯甲酸鈉的毒性作用和環(huán)境雌激素作用。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

實驗用草履蟲采集于揚(yáng)州市西區(qū)生活污水河的尾草履蟲。

1.1.2 藥品

苯甲酸鈉(分析純，上海光華化學(xué)試劑廠)。

1.2 主要儀器

XSP－13A顯微鏡，解剖鏡，LRH-250-CT光照培養(yǎng)箱，微樣移液器。

2 實驗方法

2.1 草履蟲純化培養(yǎng)與計數(shù)

采用郭峰等[4]微量分離法。用50μL微量加樣器取富集到的草履蟲樣液，在干凈玻片上一排滴5滴，每滴10μL，在5×10倍鏡下鏡檢，將含草履蟲的那一滴水轉(zhuǎn)吸到另一塊干凈載玻片上，加10μL稻草培養(yǎng)液，1∶1稀釋變成20μL，用微量加樣器在同一塊載玻片上再將其分成2滴，每滴10μL，鏡檢，將含有草履蟲的那一滴再加10μL稻草培養(yǎng)液再次1∶1稀釋變成20μL，如此重復(fù)稀釋3～5次，直到在10×100的高倍鏡下鏡檢確認(rèn)已無其他生物為止。最后，將含有草履蟲的那一滴吸入含250mL稻草培養(yǎng)液的三角燒瓶中室溫培養(yǎng)1周左右，取5滴各含10μL鏡檢，若除草履蟲外仍有少數(shù)其他生物，可重復(fù)用上述微量分離方法再次進(jìn)行分離純化。

2.2 攻毒實驗

用稻草培養(yǎng)液配制苯甲酸鈉系列稀釋液。通過逼近實驗確定最小致死劑量和絕對致死劑量。在此范圍內(nèi)設(shè)置8個苯甲酸鈉濃度組:8g·L－1、9g·L－1、10g·L－1、11g·L－1、12g·L－1、13g·L－1、14g·L－1、15g·L－1、16g·L－1、17g·L－1、18g·L－1、19g·L－1，以稻草培養(yǎng)液做空白對照，培養(yǎng)體積100μL，每管10個草履蟲，光照培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)。急性毒性實驗培養(yǎng)1h，慢性毒性實驗培養(yǎng)72h和168h。(SB濃度為10g·L－1、9g·L－1、8g·L－1、7g·L－1、6g·L－1、5g·L－1、4g·L－1、3g·L－1、2g·L－1、1g·L－1、0.8g·L－1、0.6g·L－1、0.4g·L－1、0.2g·L－1)計數(shù)存活草履蟲個體數(shù)。

2.3 數(shù)據(jù)分析及設(shè)計方法

急性毒性實驗數(shù)據(jù)處理:根據(jù)百分率與概率單位對照表，將死亡率轉(zhuǎn)換成概率單位;概率單位為Y1，濃度對數(shù)為X1，應(yīng)用SPSS軟件對概率單位(Y1)與濃度對數(shù)(X1)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程Y1=a1X1+b1，計算LC50。

慢性毒性實驗數(shù)據(jù)處理:草履蟲的種群增長速率計算公式:Y2(或Y3)=(lnNt－lnN0)·t－1，其中N0為草履蟲的起始種群密度，Nt為t(h)時草履蟲的種群密度，t為培養(yǎng)持續(xù)時間(h)。起始種群密度N0=起始個體數(shù)/培養(yǎng)液總體積;t(h)時種群密度Nt=t(h)時個體數(shù)/培養(yǎng)液總體積;應(yīng)用SPSS軟件對種群增長速率(Y2或Y3)與濃度對數(shù)(X2或X3)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程Y2=a2X2+b2及Y3=a3X3+b3，分析草履蟲種群增長率與苯甲酸鈉濃度間關(guān)系。

3 實驗結(jié)果

3.1 急性毒性實驗

3.1.1 最小致死劑量和絕對致死劑量

最小致死劑量是指在一群生物中僅引起個別生物死亡的最低劑量，低于此劑量時就不能使機(jī)體出現(xiàn)死亡。絕對致死劑量是指引起實驗生物全部死亡的最低劑量。經(jīng)過多次逼近試驗得出:苯甲酸鈉對草履蟲1h急性毒性最小致死劑量為8g·L－1，絕對致死劑量為19g·L－1。

3.1.2 半數(shù)致死濃度

半數(shù)致死濃度是使一群受試生物50%死亡的最低濃度。苯甲酸鈉梯度濃度對草履蟲1 h急性毒性實驗結(jié)果見表1。以校正死亡率對應(yīng)幾率值(Y1)與濃度對數(shù)(X1)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程Y1=10.051X1－6.563，(R2=0.965)，即濃度對數(shù)(X1)與幾率值(Y1)之間呈線性關(guān)系，濃度越大，死亡率越高。并根據(jù)回歸方程求得Y1=5時(死亡率50%)，苯甲酸鈉對草履蟲的1h LC50為14.14g·L。

表1 苯甲酸鈉對草履蟲的1h急性毒性作用結(jié)果

3.2 72h(三天)慢性毒性實驗

表2 苯甲酸鈉對草履蟲的72h慢性毒性作用結(jié)果

草履蟲72h慢性毒性實驗結(jié)果如表2所示。種群增長率(Y2)和濃度對數(shù)(X2)之間呈線性關(guān)系，其回歸方程為Y2=－0.0153X2+0.0347(R2=0.480)，即濃度在0.8－5g·L－1范圍內(nèi)，濃度對數(shù)越大，種群增長率越小;但是，如圖1所示，在低濃度范圍(0.2－0.8g·L－1)內(nèi)種群增長率有逐漸上升趨勢;在濃度5g·L－1時種群增長率急劇下降為最低值;濃度大于5g·L－1時，種群增長率又有一定上升趨勢。

3.3 168h(一周)慢性毒性實驗

草履蟲一周慢性毒性實驗結(jié)果如表3所示，種群增長率(Y3)和濃度對數(shù)(X3)之間的回歸方程為Y3=－0.00884X3+0.0155(R2=0.391;P＜0.05)。即濃度在0.6－6g·L－1范圍內(nèi)，濃度對數(shù)越大，種群增長率越小。在中低等濃度范圍內(nèi)(0.2－0.6g·L－1)濃度對數(shù)越大，種群增長率呈緩慢增加趨勢，在濃度6g·L－1時種群增長率急劇下降為最低值;濃度大于6g·L－1時，種群增長率又有一定上升趨勢。

表3 苯甲酸鈉對草履蟲的168h慢性毒性作用結(jié)果

圖1 苯甲酸鈉對草履蟲的慢性毒性作用結(jié)果

4 討論

本實驗中關(guān)于急性毒性研究的結(jié)果顯示:苯甲酸鈉溶液的濃度越高，草履蟲的死亡率越高。這與有關(guān)原生動物的急性毒性研究報道結(jié)果相似。王莉霞等[5]研究表明，氰戊菊酯對原生動物群落的48h半致死濃度LC50為15.83mg·L－1，劉慶余等[6]研究顯示，乙氰菊酯對草履蟲的1h急性毒性實驗，以甲苯為助溶劑時LC50為16.3mg·L－1，以丙酮為助溶劑時LC50為24.0mg·L－1。李霖[7－9]結(jié)果表明，三氟氯氰菊酯對草履蟲1h急性毒性LC50為1.648mg·L－1;多菌靈對草履蟲的1h LC50為0.5340mg·L－1，毒死蜱對尾草履蟲的1h LC50為0.04359mg·L－1。本實驗結(jié)果表明，苯甲酸鈉對草履蟲1h急性毒性LC50為1.103 g·L－1，顯示草履蟲對苯甲酸鈉的敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于菊酯、毒死蜱等農(nóng)藥，說明苯甲酸鈉的毒性作用是很低的，但是濃度越大，死亡率越高，表明隨著苯甲酸鈉濃度的逐步升高，其生物毒性也逐步加大。

兩組慢性攻毒實驗結(jié)果都顯示種群增長率和濃度對數(shù)之間呈線性關(guān)系，濃度對數(shù)越大，種群增長率越小，即濃度越大，對種群增長抑制作用越強(qiáng)。與1h急性毒性作用比較，苯甲酸鈉對草履蟲的最小全致死效應(yīng)濃度隨著毒性作用時間延長而降低，表明苯甲酸鈉對草履蟲的毒性作用既具有劑量效應(yīng)，又具有時間效應(yīng)。

值得注意的是72h、168h慢性毒性試驗顯示，在偏低濃度范圍時，種群增長率大于對照組;種群增長率隨著濃度的增加呈現(xiàn)逐漸上升趨勢;在中等濃度范圍內(nèi)，種群增長率隨著濃度的增加呈現(xiàn)逐漸下降趨勢;在濃度5g·L－1、6 g·L－1時種群增長率急劇下降為最低值;在越過最低值后又出現(xiàn)一定范圍內(nèi)隨濃度升高而明顯上升的趨勢。這一現(xiàn)象說明，苯甲酸鈉在一定濃度范圍內(nèi)對草履蟲生殖具有促進(jìn)作用。

EDC是對生物的繁殖、發(fā)育、行為及保持動態(tài)平衡的體內(nèi)天然激素的合成、分泌、傳輸、結(jié)合和清除起干擾作用的外源物質(zhì)。EDC具有不尋常的量效效應(yīng)，，傳統(tǒng)的毒性閾值概念并不適合它。Vom[10]等報道在一定劑量范圍內(nèi)，低劑量EDC促進(jìn)某種效應(yīng)，而高劑量的EDC卻產(chǎn)生抑制作用，形成“U”形量效曲線。李霖等[7－9]研究顯示三氟氯氰菊酯、多菌靈、毒死蜱對草履蟲慢性毒性作用在一定低濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出濃度越大，種群增長率越高的現(xiàn)象，認(rèn)為這種促進(jìn)可能是具有環(huán)境內(nèi)分泌干擾物作用的一種體現(xiàn)。本結(jié)果與其類似，尤其與三氟氯氰菊酯的作用相似，在中等濃度時濃度越高，對種群增長率的抑制作用越強(qiáng)，在越過最低值后種群增長率有逐漸上升趨勢，濃度越高，對種群增長的促進(jìn)作用越強(qiáng)。由此提示，草履蟲種群增長率與苯甲酸鈉濃度間具有顯著的反應(yīng)—劑量關(guān)系。這種反應(yīng)—劑量關(guān)系與環(huán)境雌激素效應(yīng)非常相似。苯甲酸鈉是否具有環(huán)境雌激素的效應(yīng)，還需通過進(jìn)一步研究方可定論。

此外，慢性毒性還顯示在高濃度平行組中，出現(xiàn)個別組種群增長率顯著增加而其他組全部死亡的現(xiàn)象。有可能是由于草履蟲對環(huán)境雌激素效應(yīng)的應(yīng)答具有一定個體差異，關(guān)于環(huán)境雌激素效應(yīng)的機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

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