徐 楓 王和平 孫慶林 張雄杰 宋 敏

M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)木聚糖酶的條件優(yōu)化

徐 楓 王和平 孫慶林 張雄杰 宋 敏

通過(guò)研究培養(yǎng)基料比、固液比、無(wú)機(jī)鹽、接種量以及培養(yǎng)時(shí)間等單因素對(duì)M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物的影響，并采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了固態(tài)發(fā)酵條件。研究表明，M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)木聚糖酶是可行的，影響產(chǎn)酶最主要的因素為接種量。優(yōu)化的發(fā)酵條件為胃容物50%，玉米：麥麩=5：5，CaCl2濃度0.5%，初始pH值5.0，固液比1：3，每10 g干培養(yǎng)基接種量2 ml（孢子數(shù)1.2～1.6×108cfu/ml），發(fā)酵時(shí)間72 h,發(fā)酵溫度30℃。經(jīng)優(yōu)化后的酶活水平達(dá)到了138.504 IU/ml。較已報(bào)道的同種木霉的最高發(fā)酵酶活提高達(dá)3倍左右。

生物廢棄物；低碳經(jīng)濟(jì)；羊胃容物；木霉；木聚糖酶；固態(tài)發(fā)酵

內(nèi)蒙古有著豐富的牛羊資源，每年屠宰量巨大， 在屠宰牛羊的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量牛羊胃容物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每頭（只）成年牛羊屠宰后可產(chǎn)生0.5～1.5 kg風(fēng)干瘤胃容物。反芻動(dòng)物瘤胃容物是有待開(kāi)發(fā)的可利用資源,其中含粗蛋白15.2%、粗纖維26.4%、粗脂肪6.2%、粗灰分12.1%、無(wú)氮浸出物40.1%、鈣0.71%、磷0.67%[1]。而且，其中還含有生物學(xué)價(jià)值很高的微生物菌體蛋白、維生素和各種消化酶，尤其富含維生素B12。目前胃容物作為垃圾處理，污染環(huán)境、滋生蚊蠅、產(chǎn)生惡臭。如何科學(xué)利用它們，設(shè)法變廢為寶，為科技人員提出了一項(xiàng)低碳經(jīng)濟(jì)研究的課題。

木霉（Trichoderma）可產(chǎn)木聚糖酶等，對(duì)纖維素、半纖維素類(lèi)物質(zhì)有較好的降解能力[2]。木聚糖酶能降解木聚糖中的 β-1，4糖苷鍵，去除小麥、黑麥、燕麥等谷物飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，改善動(dòng)物生產(chǎn)性能，補(bǔ)充內(nèi)源酶分泌的不足，促進(jìn)養(yǎng)分的消化和吸收，提高飼料利用率，減輕糞便對(duì)環(huán)境的污染，同時(shí)還可開(kāi)發(fā)非常規(guī)谷物資源[3]。

本文通過(guò)單因素以及正交實(shí)驗(yàn)，研究木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)木聚糖酶的最佳發(fā)酵條件，設(shè)法盡可能多地利用目前屠宰后的胃容物垃圾，其研究結(jié)果可為放大木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)木聚糖酶的最佳發(fā)酵工藝條件提供可靠的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品

木聚糖 （Xylan/Sigma）、木糖 （Xylose/Merck）、3,5-二硝基水楊酸 （均為化學(xué)純）；（NH4）2SO4、葡萄糖、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、無(wú)水乙醇、冰醋酸、無(wú)水乙酸鈉、FeSO4、KCl、ZnSO4、NaCl、MnSO4、BaCl2、MgCl2、CaCl2、CuSO4（ 均 為 分 析純）；無(wú)菌去離子水、瓊脂、麥麩、玉米粉。

1.1.2 儀器

高速冷凍離心機(jī)（HITACHI SCR20BC）、恒溫培養(yǎng)箱（上海?，敚?、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新苗）、高壓滅菌鍋（TOMY SX-500）、恒溫水浴鍋（天津華北HHS）、磁力攪拌器、精密pH計(jì)（雷磁 PHS-3B）、電子精密天平 （OHAUS AR2140）、TU-1800型紫外分光光度計(jì)（北京普析TU-1800PC）、光學(xué)顯微鏡（Olympus C011）等。

三角瓶（100 ml、250 m）l、燒杯（50 ml、100ml、200ml、500 ml、1 000 m）l、容量瓶（50 ml、100 ml、200 ml、500 ml、1 000 ml）、培養(yǎng)皿（Φ80 mm）、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、蓋玻片、無(wú)菌毛細(xì)滴管等。

封口膜、接種針、移液器（1 ml、2 ml、5 ml）等。

1.1.3 菌種

M-112木霉（M-112Trichoderma）由本研究室提供。

1.1.4 羊胃容物

采自呼和浩特市某屠宰場(chǎng)，濕物料經(jīng)高壓滅菌，風(fēng)（烘）干，粉碎，過(guò)40目篩后，置于干燥器中備用。

1.1.5 培養(yǎng)基

1.1.5.1 傳代培養(yǎng)基[馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基]

馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 20 g、蒸餾水1 000 ml，pH 值 7.0～7.2。121 ℃高壓滅菌 20 min，分裝備用。

1.1.5.2 基本固體培養(yǎng)基（麥麩、玉米）

麥麩 250 g、玉米粉 250 g、FeSO40.1%、去離子水1 500 ml,混勻，121℃高壓滅菌40 min，備用。

1.1.6 溶液

1.1.6.1 0.2 mol/l pH值5.8乙酸鈉緩沖液

溶液A:量取冰乙酸11.80 ml，用去離子水定容至1 000 ml，混勻后備用。

溶液B:準(zhǔn)確稱取1.642 g乙酸鈉（無(wú)水），用少量去離子水溶解后定容至100 ml，混勻后備用。

0.2 mol/l pH值5.8乙酸鈉緩沖液：取A液940 ml、B液60 ml，混勻即成。

1.1.6.2 1%木聚糖（Xylan）溶液

準(zhǔn)確稱取木聚糖（Xylan）1.00 g，用少量0.2 mol/l pH值5.8乙酸鈉緩沖液溶解后定容至100 ml，混勻即成（4℃冷藏備用）。

1.1.6.3 DNS（3,5-二硝基水楊酸）溶液

準(zhǔn)確稱取3,5-二硝基水楊酸 6.30 g于500 ml燒杯中，用少量去離子水溶解后，加入2 mol/l NaOH溶液260 ml，然后移加到500 ml含有18.5 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g結(jié)晶酚和5 g無(wú)水亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后移入1 000 ml容量瓶中定容至1 000 ml，充分混勻，貯存于棕色瓶中，室溫放置一周后使用。

1.1.6.4 1 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)木糖（Xylose）溶液

標(biāo)準(zhǔn)稱取木糖（Xylose）50.0 mg，用少量去離子水溶解，然后加1 mg疊氮化鈉（防腐），再用去離子水定容至50 ml，混勻即成（4℃冷藏備用）。

1.2 方法

1.2.1 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

將木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液制成如圖1所示的濃度梯度，用DNS法測(cè)定（OD550）木糖含量。以木糖濃度梯度為縱坐標(biāo)，木糖濃度梯度對(duì)應(yīng)的吸光度值（OD550）為橫坐標(biāo)，使用軟件origin7.5進(jìn)行線性擬合[4]，建立木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.865 9x+0.113 4，R2=0.997 2。

1.2.2 木聚糖酶的活性測(cè)定

1.2.2.1 粗酶液的制備

取固態(tài)發(fā)酵物，按1：5加入0.2 mol/l pH值5.8的乙酸鈉緩沖液，充分?jǐn)嚢?，將發(fā)酵物混勻，40℃水浴加熱1 h，取提取液5 ml,經(jīng)4 200 r/min，4℃下離心10 min,取清液，用醋酸鈉緩沖液稀釋10倍，即為粗酶液。

1.2.2.2 木聚糖酶的活性測(cè)定（DNS法）

在試管（做三個(gè)平行）中加粗酶液0.1 ml，0.2 mol/l pH值5.8醋酸緩沖液5.5 ml，1%木聚糖溶液0.9 ml，搖勻，50℃水浴30 min（準(zhǔn)確）。酶解完畢后取出，加DNS試劑1 ml搖勻，立即沸水浴加熱10 min，冷卻后，于550 nm下測(cè)OD值。由回歸方程及酶活定義計(jì)算酶活性。

空白管，不加底物，即用0.2 mol/l pH值5.8醋酸緩沖液代替1%木聚糖溶液加入的量，其他與待測(cè)樣管相同。

木聚糖酶活力單位定義：在最適條件下，每分鐘分解10 mg/ml木聚糖溶液產(chǎn)生1 μmol還原糖（木糖）的酶量,定義為一個(gè)木聚糖酶活力單位（U/ml）。

式中：A——所測(cè)吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的還原糖（木糖）量（mg），即用該回歸方程所計(jì)算的值；

B——酶液的稀釋倍數(shù)；

30——酶促反應(yīng)的時(shí)間（min）；

10——測(cè)定所用的0.1 ml酶液折算成1 ml酶液的換算值；

1 000——毫克還原糖（木糖）單位折算成微克還原糖（木糖）單位的換算值；

150.14——木糖（Xylose）的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.3 M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)木聚糖酶的條件優(yōu)化

1.2.3.1 固態(tài)發(fā)酵條件的單因素實(shí)驗(yàn)研究

①羊胃容物固態(tài)培養(yǎng)基接種量實(shí)驗(yàn)

調(diào)整接種懸液孢子數(shù)為1.2～1.6×108cfu/ml。設(shè)置接種量梯度（10 g干培養(yǎng)基），1、2、3、4、5 ml,共 5 個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，羊胃容物添加量為50%，固液比為1：3，30℃下培養(yǎng)72 h；制備粗酶液；DNS法測(cè)定木聚糖酶活性。結(jié)果圖示為均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差。

②羊胃容物固態(tài)培養(yǎng)基固液比實(shí)驗(yàn)

設(shè)置固液比梯度（10g干培養(yǎng)基/100ml三角瓶中），1：1、1：1.5、1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4、1：4.5、1：5，共9個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),羊胃容物添加量為50%，每10 g干培養(yǎng)基接種量為3 m（l1.2～1.6×108cfu/ml），30℃下培養(yǎng)72 h；制備粗酶液；DNS法測(cè)定木聚糖酶活性。結(jié)果圖示為均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差。

③羊胃容物與基本固體培養(yǎng)基比例實(shí)驗(yàn)

羊胃容物與基本固體培養(yǎng)基之比分別為2：8、3：7、4：6、5：5、6：4、7：3、8：2，共 7 個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每10 g干培養(yǎng)基接種量為3 m（l1.2～1.6×108cfu/ml），固液比為 1：3，30 ℃下培養(yǎng) 72 h；制備粗酶液；DNS法測(cè)定木聚糖酶活性。結(jié)果圖示為均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差。

④羊胃容物固態(tài)培養(yǎng)基添加無(wú)機(jī)鹽實(shí)驗(yàn)

在設(shè)定培養(yǎng)基中，分別添加0.1%的無(wú)機(jī)鹽（Ca2+、K+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ba2+、Na+、Mn2+），共 9 個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，羊胃容物添加量為50%，固液比為1：3，每10g干培養(yǎng)基接種量為3 m（l1.2～1.6×108cfu/m）l，30℃下培養(yǎng)72 h；制備粗酶液；DNS法測(cè)定木聚糖酶活性。結(jié)果圖示為均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.3.2 固態(tài)發(fā)酵條件的正交實(shí)驗(yàn)研究

在以上單因素實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行5因素5水平的正交實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單因素對(duì)M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)木聚糖酶的影響

2.1.1 接種量對(duì)M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)木聚糖酶的影響

圖2 接種量對(duì)木聚糖酶活力的影響

通過(guò) 5 個(gè)接種量（1、2、3、4、5 ml）的實(shí)驗(yàn)，其研究結(jié)果表明（見(jiàn)圖2），3 ml的接菌量（1.2～1.6×108cfu/m）l，使該M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)生的木聚糖酶較多。

一般微生物發(fā)酵速度的快慢，常取決于接種量的多少。接種量大，有利于基質(zhì)的利用，可以縮短發(fā)酵環(huán)境中菌絲繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物合成提前到來(lái)，并且生產(chǎn)菌迅速占據(jù)整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境，可減少雜菌生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)。但是，接種量過(guò)多，往往使菌絲生長(zhǎng)過(guò)快，培養(yǎng)液黏度增加，則造成溶解氧不足而影響產(chǎn)物的合成。接種量過(guò)小，則除了延長(zhǎng)發(fā)酵周期之外，往往還會(huì)引起其它不正常的情況[5]。較為合適的接種量，則會(huì)提升產(chǎn)物合成的水平。

2.1.2 固液比對(duì)M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)木聚糖酶的影響（見(jiàn)圖3）

圖3 固液比對(duì)木聚糖酶活力的影響

通 過(guò) 9 個(gè) 固 液 比（1：1、1：1.5、1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4、1：4.5、1：5）的實(shí)驗(yàn)，其研究結(jié)果表明，固液比為1：3時(shí)，使該M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)生的木聚糖酶較多。

水是微生物生長(zhǎng)代謝必不可少的物質(zhì),也是發(fā)酵的主要媒介,因而培養(yǎng)基中含水量的變化必然對(duì)微生物的生長(zhǎng)及代謝能力產(chǎn)生重要影響。固液比較大，會(huì)造成物料含水量較低，而導(dǎo)致物料膨脹程度低，并在發(fā)酵后期由于蒸發(fā)作用使物料干化，從而抑制菌體生長(zhǎng)，而造成產(chǎn)物產(chǎn)量降低。固液比較小，則含水量較高，會(huì)使物料多孔性降低,減少了物料內(nèi)氣體交換、通風(fēng)和降溫,不利于木霉的菌體生長(zhǎng)和對(duì)培養(yǎng)基中木聚糖的降解[6]。

2.1.3 胃容物與基本固體培養(yǎng)基比例對(duì)M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)木聚糖酶的影響（見(jiàn)圖4）

圖4 胃容物添加量對(duì)木聚糖酶活力的影響

通過(guò)7個(gè)羊胃容物與基本固體培養(yǎng)基之比（2：8、3：7、4：6、5：5、6：4、7：3、8：2）的實(shí)驗(yàn)，其研究結(jié)果表明，羊胃容物與基本固體培養(yǎng)基之比為5：5時(shí)，使該M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)生的木聚糖酶較多。

羊胃容物含有蛋白和纖維素以及種類(lèi)豐富的無(wú)機(jī)鹽等，但是也含有一些抑制木霉發(fā)酵的因素。通過(guò)控制羊胃容物加入量，一方面盡可能多的利用羊胃容物，另一方面使其產(chǎn)木聚糖酶盡可能的多。

2.1.4 無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)木聚糖酶的影響（見(jiàn)圖5）

通過(guò)分別添加9種不同無(wú)機(jī)鹽離子（K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+）的實(shí)驗(yàn)，其研究結(jié)果表明，所選的這些離子都具有促進(jìn)M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)木聚糖酶的作用，但Ca2+的促進(jìn)作用最大。

圖5 無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)木聚糖酶活力的影響

微生物生長(zhǎng)過(guò)程中需要某些無(wú)機(jī)鹽和微量元素，調(diào)節(jié)滲透壓和透性、穩(wěn)定環(huán)境pH值、構(gòu)成生物物質(zhì)、生理調(diào)節(jié)、促進(jìn)菌絲體的增殖等[7-8]。這些物質(zhì)一般在低濃度時(shí)對(duì)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成具有促進(jìn)作用，在高濃度時(shí)常表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

2.2 M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物的正交實(shí)驗(yàn)研究

采用L25（55）正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行5因素5水平正交實(shí)驗(yàn)[9]，其研究結(jié)果表明（如表1、效應(yīng)曲線圖6所示），M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)木聚糖酶的優(yōu)化條件為A3B1C2D5E2,其酶活達(dá)到138.504 IU/ml。

由極差分析可知，在M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物的過(guò)程中，各因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活性的影響程度有所不同，其影響程度由大到小順序依次為：接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞玉米與麥麩比例＞無(wú)機(jī)鹽濃度＞初始pH值。接種量與發(fā)酵時(shí)間是M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)木聚糖酶生產(chǎn)工藝中最主要的影響因素，只有控制最合適的接種量和發(fā)酵時(shí)間才能產(chǎn)生更多的木聚糖酶。初始pH值對(duì)羊胃容物固態(tài)發(fā)酵的影響較小，說(shuō)明M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物對(duì)pH值變化具有一定的自我調(diào)節(jié)和適應(yīng)能力。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6 效應(yīng)曲線

3 結(jié)論

通過(guò)培養(yǎng)基料比、固液比、無(wú)機(jī)鹽、接種量、培養(yǎng)時(shí)間等單因素以及正交實(shí)驗(yàn)對(duì)M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)木聚糖酶的影響研究，其優(yōu)化條件為：胃容物 50%、玉米：麥麩=5：5、無(wú)機(jī)鹽（CaCl2）濃度0.5%、初始pH值5.0、固液比 1：3，每10 g干培養(yǎng)基接種量 2 ml（孢子總數(shù) 1.2～1.6×108cfu/ml），發(fā)酵時(shí)間72 h,發(fā)酵溫度30℃，M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)生的木聚糖酶活性可達(dá)到138.504 IU/ml，較已報(bào)道的同種木霉的最高發(fā)酵酶活提高達(dá)3倍以上[10]，證明M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)木聚糖酶是可行的。實(shí)驗(yàn)為放大M-112木霉固態(tài)發(fā)酵羊胃容物產(chǎn)木聚糖酶的最佳發(fā)酵工藝條件，設(shè)法盡可能多的利用目前屠宰后的胃容物垃圾變廢為寶（低碳經(jīng)濟(jì)利用）提供了可靠的參考數(shù)據(jù)。

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TQ920.6

A

1001-991X（2011）04-0020-05

徐楓，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，010018，呼和浩特。

王和平（通訊作者）、孫慶林、張雄杰、宋敏，單位及通訊地址同第一作者。

2010-10-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（39870558）

（編輯：高 雁，snowyan78@163.com）