謝 放，田 偉，朱子雄

（蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅 蘭州 730070）

草甘膦（glyphosate）是目前世界上使用量最大的除草劑，化學名為N-膦酸甲基甘氨酸。草甘膦在進入植物體內(nèi)以后，會和磷酸烯醇式丙酮酸競爭性地與5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）結(jié)合，使EPSPS永久地失去活性。EPSPS主要存在于細菌、真菌、藻類和高等植物體內(nèi),它是生物合成芳香族氨基酸（包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）過程中一個重要的酶[1]。

隨著雜草對于草甘膦耐受性的增強，我們需要不斷的提高使用草甘膦的次數(shù)以及濃度，一旦超過作物的耐受程度，則作物也會隨之受害，進而造成經(jīng)濟損失。目前市場上的草甘膦抗性菌株的基因來源主要是對于草甘膦耐受性好的微生物中，因此，本研究從生產(chǎn)草甘膦工廠的污水處理池邊的土壤中，分離出抗性菌株，并鑒定得到草甘膦抗性基因，以期獲得抗更高濃度轉(zhuǎn)基因作物提供研究材料。

1 材料與方法

1.1 土樣

江蘇輝豐公司污水處理池邊的土壤。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 LB培養(yǎng)基 酵母膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，加水至 1 L，pH 7.0，121℃滅菌 21 min。1.2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基[2]KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.04 g，加水至1 L，pH 值 7.0，過濾滅菌。

1.2.3 鑒定培養(yǎng)基 見文獻[3]

1.3 主要藥品

95%草甘膦原藥,其余藥品為國產(chǎn)分析純。引物[4]：F 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，R 5′-T ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.4 方法

1.4.1 降解菌的富集與篩選 稱取土壤5 g，置于100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（草甘膦濃度為200 mg/L），120 r/min、30℃搖床培養(yǎng)7 d。后以2%的接種量進行連續(xù)轉(zhuǎn)接，每次轉(zhuǎn)接草甘膦的濃度遞增為400、600、800和1 000 mg/L。最后在LB培養(yǎng)基平板中進行劃線分離培養(yǎng)，連續(xù)數(shù)次，得到單菌落。

1.4.2 菌種在含有草甘膦基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長曲線的測定 將活化后的菌液以2%的接種量接種到800 mg/L的草甘膦基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，120 r/min，30℃搖床培養(yǎng)，每隔24 h進行OD600值的測量。

1.4.3 LB培養(yǎng)基中不同NaCl濃度和不同pH值對菌體生長的影響 將活化后的菌種以1%的接種量分別接入不同NaCl（1～10g/L）濃度和不同pH值（2～11）的 LB 培養(yǎng)基中，120 r/min，30℃下?lián)u床培養(yǎng)24 h后測定OD600。

1.4.4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中NaCl濃度對菌體降解草甘膦的影響 將活化后的菌種以2%的接種量接種到不同NaCl濃度的（0～1 g/L）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（草甘膦濃度為 200 mg/L）中，120 r/min，30℃搖床培養(yǎng) 3 d 后測定OD600。

1.4.5 菌體在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中對草甘膦耐受性的檢測 將活化后的菌種以2%的接種量接種到不同濃度的草甘膦（100～1000 mg/L）基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，120 r/min，30℃下?lián)u床培養(yǎng)3 d后測定OD600。

1.4.6 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不同葡萄糖濃度對菌體降解草甘膦的影響 將活化后的菌種以2%的接種量接種到不同葡萄糖濃度的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，120 r/min，30℃下?lián)u床培養(yǎng)3 d后測定OD600。

1.4.7 菌體特性[3]過氧化氫酶實驗，甲基紅實驗，H2S實驗，明膠實驗，吲哚實驗，革蘭氏染色，菌體形態(tài)觀察，菌落觀察，葡萄糖利用實驗，檸檬酸鹽利用實驗。

1.4.8 菌體分子鑒定 將菌體的基因組DNA提出，并利用16S rDNA通用引物進行擴增，得到的序列由上海生工進行測序。將測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST序列比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦降解菌的分離

在經(jīng)過5次富集后，在LB培養(yǎng)基中選取生長較快、菌落較大的菌株進行反復純化培養(yǎng)。最終共得到菌株9種，按篩選次序依次命名為Z-1、Z-2、Z-3、…、Z-9。選擇最先選出的Z-1菌種進行后續(xù)實驗。

2.2 Z-1菌種在含有草甘膦基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長曲線的測定

圖1可知，Z-1菌種剛接入培養(yǎng)液中，經(jīng)過對新的環(huán)境進行適應后，進入快速生長期，第2天菌體進入了生長的穩(wěn)定期，并持續(xù)了6 d。第8天后轉(zhuǎn)入衰亡期，菌體數(shù)量減少。

2.3 LB培養(yǎng)基中不同鹽濃度對Z-1菌種生長的影響

圖1 菌體Z-1的生長曲線

圖2可知，Z-1菌種在NaCl濃度少于6 g/L時，NaCl為菌體快速生長的限制因素，菌種生長處于平穩(wěn)的狀態(tài)。而后，隨著鹽濃度的增大而菌體生物量增大，在NaCl濃度為8 g/L達到了最大生物量。當NaCl濃度繼續(xù)增長時，由于高鹽濃度的存在，Z-1菌種的生長受到了抑制，從而使吸光度減弱。

圖2 LB培養(yǎng)基中不同NaCl濃度對Z-1菌種生長的影響

2.4 LB培養(yǎng)基中不同pH值對Z-1菌種生長的影響

圖3可知，Z-1菌在pH為2～11中都可以生長。在pH為6、7、8的時候長勢最好，pH為其他值時，菌體的長勢較弱。此次分離的菌種生活在污水處理池的旁邊，所處的環(huán)境并非極端環(huán)境。因此，Z-1菌在中性和弱酸弱堿的范圍內(nèi)生長較好。

圖3 LB培養(yǎng)基中不同pH值對Z-1菌種生長的影響

2.5 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中NaCl濃度對Z-1菌種降解草甘膦的影響

圖4可以看出，菌種Z-1在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，當NaCl濃度小于0.7 g/L的時候，菌體生長會隨著Na－Cl的濃度增加而生長加快，也就是說降解草甘膦的速率增加。當NaCl濃度大于0.7 g/L時，由于NaCl的濃度增加，使得培養(yǎng)液中的滲透壓增大，導致菌種生長處于不良好的狀態(tài)，菌體生長速度減緩。在濃度為1.0 g/L時，生長量到達了最小。

圖4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不同NaCl濃度對Z-1菌種生長的影響

2.6 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中Z-1菌種對草甘膦耐受性的檢測

圖5可以看出：菌種Z-1在低濃度的草甘膦培養(yǎng)基中可以較好的生長，隨著草甘膦濃度的升高，Z-1菌的酶系統(tǒng)受到了一定程度的干擾，因此生長受到了抑制。在草甘膦原藥濃度為1 000 mg/L時，Z-1菌仍然可以繼續(xù)生長，說明草甘膦并沒有徹底破壞菌體的生理結(jié)構(gòu)，只是抑制了菌體內(nèi)EPSPS的活性。

圖5 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不同濃度草甘膦對Z-1菌種生長的影響

2.7 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不同濃度葡萄糖對Z-1降解草甘膦的影響

圖6可知，在低濃度階段，葡萄糖為菌體的生長提供了能量，菌體生物量隨著葡萄糖濃度的增加而增加。當葡萄糖的濃度達到15 g/L時，菌種Z-1的生長達到了最大。當葡萄糖濃度大于15 g/L時，滲透壓的增大影響了菌體生長，菌體生長受到抑制。

2.8 Z-1菌種特性的研究結(jié)果

Z-1菌體為桿狀，革蘭氏陰性菌，化能異養(yǎng)，過氧化氫酶陽性，H2S產(chǎn)生陰性，明膠液化陰性，吲哚實驗陽性，甲基紅實驗陰性，可以利用葡萄糖與檸檬酸鹽生長。

圖6 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不同葡萄糖濃度對Z-1菌種生長的影響

2.9 分子鑒定結(jié)果

利用F和R雙引物對Z-1的16s rDNA進行擴增，將得到的1.5 kb個片段進行測序。測序結(jié)果最終得到了一個1 423 bp的序列。在NCBI進行BLAST比對，與很多種蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）菌種的相似度都達到了99%，結(jié)合菌種的部分生理特征，鑒定為屬于蒼白桿菌屬。

3 小結(jié)與討論

湯明強[5]在研究中指出，C-17菌種在3 000 mg/L的草甘膦培養(yǎng)基中的穩(wěn)定期為2 d，本研究中Z-1菌種的穩(wěn)定期達到了6 d。這可能受以下因素影響：Z-1菌種的整個生理功能以及酶系統(tǒng)還是受到了草甘膦的抑制，所有分解草甘膦的關(guān)鍵酶沒有最大程度的發(fā)揮作用，因此菌種的生長并沒有達到自身生長的一個最大值，使培養(yǎng)基中的草甘膦利用時間變長。在后續(xù)的實驗中可以將Z-1菌種的草甘膦抗性基因以及aroA基因通過與高抗性基因的對比，確定它們之間的差異，為改良酶的特性獲取理論依據(jù)。

本實驗中葡萄糖的加入可以加快菌體利用草甘膦的速率[6]。由于測定時間為3 d，拐點后的生長量下降，可能的原因有二：（1）高濃度的葡萄糖改變了滲透壓從而影響到了菌體的生長；（2）由于葡萄糖濃度高，使菌體生長迅速導致快速降解完畢草甘膦，菌體因缺少氮源而造成生長量的下降。具體的原因還需要更進一步的實驗證明。

[1]盧 信，趙炳梓，張佳寶，等.除草劑草甘膦的性質(zhì)與環(huán)境行為的綜述[J].土壤通報，2005，36（5）：785-790.

[2]鄭永良，劉德立，劉世旺.兩株草甘膦降解真菌的分離及其降解效能研究[J].黃岡師范學院學報，2006，26（3）：28-30.

[3]東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社出版，2001.

[4]沙紀瑩，金 丹，陸 偉，等.極端污染環(huán)境草甘膦抗性菌株的分離、鑒定及特性[J].微生物學報，2008，48（6）：824-828.

[5]湯鳴強，陳景香.草甘膦降解菌C-17的分離鑒定及生物學特性[J].福建師范大學福清分校學報，2010（2）：

[6]葉 明，陳九山，姚曉慶.一株草甘膦降解菌分離鑒定及其降解特性研究[J].環(huán)境科學與技術(shù)，2009，32（3）：