王 巍,張曉希,劉新光

(廣東醫(yī)學院:1.臨床血液檢驗學教研室;2.檢驗醫(yī)學研究所,東莞 523808;3.中國人民解放軍第四二二醫(yī)院,廣東湛江 524023)

兩種常用轉染試劑轉染siRNA至HL-60細胞轉染效率的比較*

王 巍1,張曉希3,劉新光2△

(廣東醫(yī)學院:1.臨床血液檢驗學教研室;2.檢驗醫(yī)學研究所,東莞 523808;3.中國人民解放軍第四二二醫(yī)院,廣東湛江 524023)

目的比較兩種常用轉染試劑轉染小干擾RNA(siRNA)至懸浮細胞的轉染效率及對細胞毒性的影響。方法以羧基熒光素(FAM)標記的siRNA為報告基因,以lipofectamine 2000和siPORT NeoFX為轉染試劑,用流式細胞儀檢測轉染效率,倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài),M TT法檢測細胞存活率。結果siRNA＞100 nmol/L時,lipofectamine 2000的轉染效率高于siPORT NeoFX(P＜0.05);siRNA＜100 nmol/L時,前者低于后者(P＜0.05)。siRNA終濃度及轉染試劑用量相同時,lipofectamine 2000組HL-60細胞存活率與SiPORT NeoFX組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論在使用高濃度siRNA時,lipofectamine 2000對HL-60細胞有較高的轉染效率和較小細胞毒性。

脂質體;轉染;RNA,小分子干擾

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象[1-3]。目前,該技術已經成為研究基因功能的有力工具,同時也為腫瘤的治療提供了新的思路[4]。轉染試劑的選擇及轉染條件的優(yōu)化對于利用RNAi介導的基因沉默實驗來說至關重要。脂質體是常用的轉染試劑,lipofectamine 2000為廣譜轉染試劑,對DNA和RNA均可有效轉染[5-8],較為經典。siPORT NeoFX為近幾年才出現(xiàn)的小干擾RNA(siRNA)專用轉染工具。本文從轉染效率和細胞毒性兩方面研究上述兩種轉染試劑介導化學合成siRNA轉染HL-60細胞的轉染效果,旨在為siRNA轉染懸浮細胞轉染試劑的選擇提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑 HL-60細胞株由本室保存。羧基熒光素(FAM)標記的化學合成siRNA(siRNA-FAM)為上海吉瑪公司產品,lipofectamine 2000、optim-M EM培養(yǎng)基為Invitrogen公司產品,siPORT NeoFX為Ambion公司產品。

1.2 方法

1.2.1 lipofectamine 2000-siRNA混合物的制備和細胞轉染

HL-60細胞復蘇后培養(yǎng)至第3～4代,調整細胞濃度為2.0×105/mL,500微升/孔,接種于 24孔板。optim-M EM 培養(yǎng)基稀釋 siRNA-FAM 至終濃度分別為 30、50、70、90、100、150、200 nmol/L,每個濃度混合物總體積為50 μ L。optim-M EM 培養(yǎng)基49微升/孔,lipofectamine 2000 1微升/孔,室溫孵育 5 min。然后混合稀釋的siRNA-FAM和稀釋的lipofectamine 2000(共100μ L),室溫放置 20 min,使 lipofectamine 2000-siRNA 復合物形成。加入各濃度復合物到相應孔中,混勻,每孔總體積為600μ L,37℃、培養(yǎng)6 h,用流式細胞儀檢測轉染效率。

1.2.2 siPORT NeoFX-siRNA混合物的制備和細胞轉染調整細胞濃度為1.0×105/mL,450微升/孔,接種于 24孔板。optim-M EM培養(yǎng)基稀釋siRNA-FAM至上述各終濃度,每個濃度混合物總體積25 μ L。optim-M EM 培養(yǎng)基 24微升/孔,siPORT NeoFX 1微升/孔,室溫孵育10 min。然后混合稀釋的siRNA-FAM 和稀釋的 siPORT NeoFX,室溫放置 10 min。加入siPORT NeoFX-siRNA復合物到各孔中,混勻,每孔總體積500 μ L,同法檢測轉染效率。

1.2.3 轉染效率測定 FAM是一種綠色熒光基團,激發(fā)波長為480 nm,發(fā)射波長為520 nm。細胞轉染6 h后用流式細胞儀計數10 000個細胞,計算陽性細胞百分率。

1.2.4 M TT法檢測轉染混合物對細胞的毒性 將細胞接種于96孔板,按轉染試劑說明書操作步驟轉染siRNA至HL-60細胞,siRNA終濃度為150 nmol/L,lipofectamine 2000和si-PORT NeoFX用量均為0.25 μ L,每組設5個復孔,24 h后用MT T法檢測細胞存活率。

1.2.5 顯微鏡觀察轉染后細胞形態(tài) siRNA終濃度為150 nmol/L,6 h后用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 數據分析用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,計量資料以±s表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩種轉染試劑轉染HL-60細胞效率比較 lipofectamine 2000和siPORT NeoFX的轉染效率均隨siRNA濃度增高而增加,但 siRNA＞150 nmol/L后,轉染效率無明顯增加。當siRNA＞100 nmol/L時,對于同一濃度siRNA,lipofectamine 2000的轉染效率高于siPORT NeoFX(P＜0.05);而 siRNA＜100 nmol/L時,siPORT NeoFX的轉染效率則高于lipofectamine 2000(P＜0.05),見表 1、圖 1。

表1 lipofectamine 2000和siPORT NeoFX轉染效率比較( ±s,%,n=3)

表1 lipofectamine 2000和siPORT NeoFX轉染效率比較( ±s,%,n=3)

*:P＜0.05,與lipofectamine 2000組比較。

siRNA濃度(nmol/L) lipofectamine 2000組 siPORT NeoFX組30 25.84±3.171 44.59±3.833*50 28.70±3.466 49.63±3.724*100 66.26±6.117 53.58±2.747*150 75.47±3.100 65.44±4.570*200 76.57±2.737 42.59±6.574*

圖1 流式細胞儀檢測lipfectamine 2000和siRNA NeoFX轉染效率

2.2 兩種轉染試劑對HL-60細胞形態(tài)學變化影響 HL-60細胞加入lipofectamine 2000后,部分細胞形態(tài)變得不規(guī)則,而siPORT NeoFX對細胞形態(tài)則無明顯影響,見封2圖2。

2.3 兩種轉染試劑對HL-60細胞增殖的比較 siRNA終濃度及轉染試劑用量相同時,siPORT NeoFX組HL-60細胞存活率為(88.7±3.4)%,lipofectamine 2000組為(82.4±2.9)%,兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討 論

陽離子脂質體是目前比較常用且有效的轉染試劑[9-11],具有較高的生物安全性和較小的細胞毒性,且操作簡單[12-15]。DNA、RNA帶有負電荷,陽離子脂質體通過自身的陽離子同DNA、RNA結合,形成帶正電荷的聚合物并與帶負電荷的細胞膜融合,通過內吞作用將DNA、RNA導入細胞[16]。

懸浮細胞的轉染效率一直都不高,為獲得滿意的干擾效果,選擇高效、低毒的轉染試劑進行細胞轉染顯得尤為重要。lipofectamine 2000是公認的轉染效果較佳的陽離子脂質體,siPORT NeoFX為siRNA專用轉染工具。本文對兩種轉染試劑在不同siRNA濃度下的轉染效率檢測顯示,轉染較高濃度siRNA(＞100 nmol/L)時,lipofectamine 2000的轉染效率高于siPORT NeoFX,而 siPORT NeoFX對低濃度 siRNA(＜100 nmol/L)的轉染效率則優(yōu)于lipofectamine 2000。在細胞毒性方面,siRNA濃度和脂質體用量相同時,lipofectamine 2000轉染可引起細胞輕微的形態(tài)改變,且細胞存活率低于 siPORT NeoFX組,但兩組差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.05),提示 lipofectamine 2000對HL-60細胞的毒性雖大于siPORT NeoFX,但其影響是可以接受的。因此,siRNA用量在100 nmol/L以上時,建議使用lipofectamine 2000進行轉染。

[1]Fire A,Xu S,Montgomery M K,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811.

[2]Lipardi C,Wei Q,Paterson BM.RNAi as random degradative PCR:siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generate new siRNAs[J].Cell,2001,107(3):297-307.

[3]Hannon GJ.RNA interference[J].Nature,2002,418(6894):244-251.

[4]李連喜,胡仁明.RNA干擾在疾病治療中的研究及應用進展[J].國際內科學雜志,2007,34(7):400-403,431.

[5]Ebadi P,Karimi M H,Pourfathollah AA,et al.The efficiency of CD40 down regulation by siRNA and antisense ODN:comparison of lipofectamine and FuGENE6[J].Iran J Immunol,2009,6(1):1-11.

[6]支德福,王冰,崔韶輝,等.兩種陽離子脂質體介導基因轉染的比較研究[J].藥學學報,2009,44(5):55.

[7]徐忠燁,程遠,朱曉峰,等.攜帶 IRES的hBDNF綠色熒光蛋白表達載體的構建和鑒定[J].重慶醫(yī)學,2008,37(10):1057-1059,封3.

[8]李艷,張必良.VEGFR1基因特異性siRNA的篩選[J].安徽農業(yè)科學,2008,36(18):7862-7864,7888.

[9]Li SD,Huang L.Gene therapy progress and prospects:non-viral vectors[J].Gene Ther,2006,13(18):1313-1319.

[10]Mark ED.Non-viral gene delivery systems[J].Curr Opin Biotechnol,2002,13(2):128-131.

[11]Le-Goff MM,Hindson VJ,Jowitt TA,et al.Characterization of opticin and evidence of stable dimerization in solution[J].J Biol Chem,2003,278(46):45280-45287.

[12]Gao X,Huang L.Cationic liposome-mediated gene transfer[J].Gene Ther,1995,2(10):710-722.

[13]T sukamoto M,Ochiya T,Sugimura ST,et al.Gene transfer and expression in progeny after intravenous DNA injection into pregnant mice[J].Nat Genet,1995,9(3):243-248.

[14]Niculescu-Duvaz D,Heyes J,Springer CJ.Structure-activity relationship in cationic lipid mediated gene transfection[J].Curr Med Chem,2003,10(14):1233-1261.

[15]Hirko A,Tang F,Hughes JA.Cationic lipid vectors for plasmid DNA delivery[J].Curr Med Chem,2003,10(14):1185-1192.

[16]Niidome T,Urakawa M,Sato H,et al.Gene transfer into hepatoma cells mediated by galactose-modified alpha-helical peptides[J].Biomaterials,2000,21(17):1811-1819.

Efficiency comparison of two transfection reagents on transfecting siRNA to HL-60 cells*

Wang Wei1,Zhang Xiaoxi3,LiuXinguang2△
(1.Department of Clinical Hematology Laboratory;2.Institute of Laboratory Medicine,Guangdong Medical College,Dongguan 523808,China;3.422th Hospital of People′s Liberation Army,Zhanjiang,Guangdong 524023,China)

ObjectiveTo compare the transfection efficiency and cytotoxicity between two cationic transfection reagents.MethodsSmall interfering RNA(siRNA)marked with FAM as a report gene,lipofectamine 2000 and siPORT NeoFX were used as the transfection reagents.Flow cytometer,microscope and MT T assay were used to detect transfection efficiency and cytotoxicity.ResultsThe transfection efficiency of lipofectamine 2000 was higher than siPORT NeoFX when siRNA was over 100 nmol/L(P＜0.05),otherwise with siRNA under 100 nmol/L(P＜0.05).At the same siRNA concentration and transfection reagent volume,there was no significant difference of vial cells ratios between two groups(P＞0.05).Conclusionlipofectamine 2000 is an effective and safe transfection reagent to HL-60 cells when siRNA is over 100 nmol/L.

liposomes;transfection;RNA,small interfering

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.04.001

A

1671-8348(2011)04-0313-02

廣東省教育廳自然科學研究項目(Z03042)?！? class="emphasis_bold">通訊作者,

,Tel:(0769)22896371;E-mail:xgliu64@163.com。

2010-05-10

2010-09-01)

·臨床研究·