周國林，林處發(fā)，胡偵華，丁毅，鄧耀華，汪愛華

（1.武漢市蔬菜科學(xué)研究所，430065；2.武漢大學(xué)植物發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）

小白菜和菜薹細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型的分子鑒定

周國林1，林處發(fā)1，胡偵華1，丁毅2，鄧耀華1，汪愛華1

（1.武漢市蔬菜科學(xué)研究所，430065；2.武漢大學(xué)植物發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）

通過檢索NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫獲得orf 138和orf 224開放閱讀框序列，依據(jù)其保守序列設(shè)計(jì)2對引物，對幾種來源不同的小白菜和菜薹細(xì)胞質(zhì)不育系及其保持系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。orf 138引物在小白菜和菜薹細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中均擴(kuò)增出573 bp的片段，orf 224引物只在一個(gè)菜薹雄性不育系中擴(kuò)增出653 bp的片段。同源性比對發(fā)現(xiàn)orf 138引物在雄性不育系中擴(kuò)增的片斷與orf 138基因同源度達(dá)100%，表明這幾個(gè)雄性不育系類型分別為蘿卜細(xì)胞質(zhì)不育類型；orf 224引物在雄性不育系中擴(kuò)增的片斷與orf 224基因同源度達(dá)100%，表明這一雄性不育系類型為甘藍(lán)型油菜不育類型。

小白菜；菜薹；細(xì)胞質(zhì)雄性不育

在十字花科作物的優(yōu)勢育種中，除利用自交不親和系以外，利用雄性不育系也是一條重要的途徑。利用雄性不育可以省去人工去雄過程，因此在農(nóng)作物雜種優(yōu)勢利用上有重要應(yīng)用價(jià)值。細(xì)胞質(zhì)雄性不育 （CMS）是由線粒體基因組的重排引起的，CMS相關(guān)基因產(chǎn)生一種新的蛋白質(zhì)，直接或間接破壞線粒體正常的生理功能，從而導(dǎo)致花粉敗育[1]。在蕓薹屬作物中已鑒定和分離出一些與CMS有關(guān)的線粒體基因，如Ogu型蘿卜的orf 138[2]、Pol型甘藍(lán)型油菜的orf 224、Nap型甘藍(lán)型油菜的orf 222[3]以及葉用芥菜的orf 220[4]等，而研究最多、利用最廣泛的是Ogu CMS和Pol CMS[5]。

試驗(yàn)利用油菜線粒體CMS基因特異性引物及基于重復(fù)序列的PCR引物對幾種來源不同的小白菜和菜薹細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料和保持系材料進(jìn)行分析和鑒定，以建立有效的小白菜和菜薹細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子鑒定方法，為雜交品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小白菜不育系材料8份，保持系材料3份；菜薹不育系材料2份，保持系材料1份，具體見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

①基因組的提取和引物設(shè)計(jì) 基因組DNA的提取參照CTAB法[6]。根據(jù)油菜線粒體中的orf 138和orf 224開放閱讀框保守區(qū)序列設(shè)計(jì)2對引物，引物交由金瑞斯生物科技公司合成，引物序列見表2。

②PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PX2 ThermalCycler（Thermo Hybaid）PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為：DNA 模板 6 ng，10×buffer 2.5 μL（含 MgCl2），1.5 mmol/L dNTP，0.4 U Tag DNA聚合酶（MBI），0.6 μL引物（25 pmol/μL），加水至25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃30 s，50℃45 s，72℃2 min，共35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后再在72℃繼續(xù)延伸10 min于4℃保存。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖（西班牙產(chǎn)）凝膠上電泳分離（5 V/cm），電泳結(jié)束后在紫外燈下觀察照相。

表1 供試的小白菜、菜薹細(xì)胞質(zhì)不育系和保持系材料

表2 基于orf 138和orf 224基因設(shè)計(jì)的引物

③PCR特異條帶的連接轉(zhuǎn)化克隆和測序 連接體系為5 μL，0.5 μL pGEM-T載體，0.5 μL Ligase，2.5 μL 2×Ligase，1.5 μL PCR產(chǎn)物，然后16℃連接過夜，再轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌液PCR，利用菌液PCR測序分析。

④序列分析 將特異DNA片段的核苷酸序列在 NCBI網(wǎng)上應(yīng)用 BLAST命令（http://www.ncbi. nlm.nih.Gov/blast）進(jìn)行氨基酸序列同源性比對。

圖1 a.orf 138引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜；b.orf 224引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜

2 結(jié)果與分析

2.1 orf 138和orf 224引物的擴(kuò)增結(jié)果

用設(shè)計(jì)的orf 138引物和orf 224引物對12份小白菜和3份菜薹材料的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。用orf 138設(shè)計(jì)的引物在不同材料間進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果表明不同材料間存在差異，在小白菜材料紫紅A、WS-1、WS-2、WS-3、WSX-4、WSX-5、蘇A07A、奶A和菜薹HA1不育系中擴(kuò)增出600 bp左右的條帶，大小相同（圖1a）；而保持系材料間均沒有擴(kuò)增出條帶。用orf 224特異引物進(jìn)行不同材料的PCR擴(kuò)增，只在紅菜薹材料HA1中擴(kuò)增出650 bp左右的條帶，其他不育材料及保持系材料間均沒有擴(kuò)增出差異條帶（圖1b）。

圖2 小白菜CMS與Ogu CMS蘿卜orf 138核苷酸序列同源性比較

圖3 紅菜薹CMS與Pol CMS蘿卜orf 224核苷酸序列同源性比較

2.2 測序和同源性比較

分別選取在orf 138引物和orf 224引物擴(kuò)增出條帶的供試材料陽性克隆進(jìn)行測序。利用NCBI在線Blast功能對測序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明利用orf 138的保守序列設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增出的片段的核苷酸序列一致性達(dá)到100%，長度均為573 bp，該片段與Ogu型胞質(zhì)不育蘿卜線粒體開放讀碼框orf 138同源性為100%（圖2），說明幾個(gè)來源不同的小白菜和菜薹胞質(zhì)雄性不育材料同屬于蘿卜細(xì)胞質(zhì)不育類型；同樣利用orf 224的保守序列設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增出的片段的核苷酸的長度為653 bp，該片段與Pol型胞質(zhì)不育甘藍(lán)型油菜線粒體開放讀碼框orf 224同源性為100%（圖3），說明這個(gè)菜薹材料HA1的不育類型屬于甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育。

3 小結(jié)與討論

十字花科包含許多重要的經(jīng)濟(jì)類作物，如大白菜、不結(jié)球白菜、甘藍(lán)、蘿卜、菜薹、甘藍(lán)型油菜等。優(yōu)勢育種是十字花科作物品種改良的重要途徑。在十字花科作物的優(yōu)勢育種中，利用雄性不育系是一條重要的途徑。研究最多、利用最廣泛的主要有轉(zhuǎn)育的蘿卜Ogu CMS、甘藍(lán)型油菜Pol CMS。Ogu CMS是小倉于1968年在日本鹿兒島一個(gè)蘿卜品種留種田中發(fā)現(xiàn)的雄性不育個(gè)體（表現(xiàn)花蕾小，花柱彎曲，雄蕊正常），后經(jīng)選育而成不育系，對Ogu型胞質(zhì)不育蘿卜的大量研究證明，orf 138開放閱讀框的確可引起Ogu型胞質(zhì)不育[2]，Ogu胞質(zhì)雄性不育系是迄今發(fā)現(xiàn)的不育源中不育性表現(xiàn)最為穩(wěn)定的類型，已經(jīng)被轉(zhuǎn)育到十字花科的其他作物中，如不結(jié)球白菜、甘藍(lán)等。Pol CMS是從甘藍(lán)型油菜品種Polma群體中發(fā)現(xiàn)的不育株經(jīng)選育得到的，orf 224開放閱讀框的確可引起Pol型胞質(zhì)不育。國際上認(rèn)為Pol CMS是當(dāng)今世界上最有生產(chǎn)價(jià)值的胞質(zhì)雄性不育系，不僅在油菜雄性不育系的選育中被廣泛利用，而且在其他十字花科作物雄性不育系的選育中也被廣泛應(yīng)用[7～9]。

本研究利用同源序列的候選基因法快速鑒定了小白菜和菜薹的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系，明晰了供試小白菜和菜薹的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型，為今后更好地開展細(xì)胞質(zhì)雄性不育系在育種中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，為實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢育種提供了分子依據(jù)。小白菜是異花授粉作物，雜種優(yōu)勢非常明顯，優(yōu)良組合比常規(guī)品種一般增產(chǎn)30%左右。但是研究也發(fā)現(xiàn)小白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系來源單一，因此要繼續(xù)收集不同類型的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型、進(jìn)行屬間不同胞質(zhì)雄性不育型之間的轉(zhuǎn)育，發(fā)現(xiàn)或者創(chuàng)造新型胞質(zhì)雄性不育型，以實(shí)現(xiàn)育種的豐富性和多樣性。

[1]Hanson M R.Plant mitochondrial mutations and male sterility[J].Annual Review of Genetics,1991(25):461-486.

[2]Bonhomme S,Budar F,Lancelin D,et al.Sequence and transcript analysis of theNco2.5Ogura-specific fragment correlated with cytoplasmic male sterility inBrassicacybrids [J].Molecular Genetics and Gene,1992,235(2-3):340-348.

[3]Brown G G,Domaj M,DuPauw M,et al.Molecular analysis ofBrassicaCMS and its application to hybrid seed production [J].Acta Horticulturae,1998(459):265-274.

[4]楊景華，張明方，喻景權(quán)，等.葉用芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因orf 220的分子特性 [J].遺傳學(xué)報(bào)，2005，32（6）：594-599.

[5]侯喜林，曹壽椿，吳志行.十字花科作物幾種主要細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型及其利用[J].長江蔬菜，1999（5）：1-4.

[6]Murray M G,Thompson W F.Rapid isolation of highmolecular weight plant DNA[J].Nucleic Acid Research,1980 (8):4 321-4 327.

[7]朱玉英，吳曉光，龔靜，等.蘿卜胞質(zhì)青花菜雄性不育系的選育及其利用[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24（3）:15-18.

[8]周邦福，李顯石，石磊.天津型大白菜雄性不育系的選育及利用[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，34（2）：190-192.

[9]戴忠良，秦文斌，姚悅梅，等.甘藍(lán)胞質(zhì)雄性不育系的選育[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，24（5）：731-732.

Molecular Identification of Cytoplasmic Male Sterile Types Non-heading Chinese Cabbage and Chinese Flowering Cabbage

ZHOU Guolin1,LIN Chufa1,HU Zhenhua1,DING Yi2,DENG Yaohua1,WANG Aihua1
(1.Wuhan Vegetable Science Research Institute,430065; 2.College of Life Science/Key Laboratory of Plant Developmental Biology,Ministry of Education,Wuhan University)

In order to identify the cytoplasmic male sterile (CMS)types in non-heading Chinese cabbage(Brassica campestrisL.ssp.chinensisMakino)and Chinese flowering cabbage (B.campestrisL.var.purpureaBaileysh),two pairs primers were designed based on the conserved domains of the sequences of orf 138 and orf 224 genes were got by searching the nucleotide databases of NCBI.The result indicated that a 573 bp specific fragment was produced in all the CMS lines by amplification with the orf 138 primer.The sequence alignment showed that the specific fragment of 573 bp from the CMS lines and the Ogu orf 138 of Ogu CMS in radish reached 100%in homology.Also the specific fragment of 653 bp from the Chinese flowering cabbage CMS line achieved 100%in homology with the Pol orf 224 of Pol CMS in rapeseed (B.napusL.).

Non-heading Chinese cabbage;Chinese flowering cabbage;Cytoplasmic male sterile

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.04.006

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（Nycytx-35-syz19）

汪愛華（1979－），女，通信作者，博士研究生，現(xiàn)從事蔬菜育種研究，E-mail：wangaihualt@163.com

2010-09-16