尹 楠，茹 峰，王東文

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，山西太原 030001

輸尿管部分梗阻后平滑肌細(xì)胞中游離Ca2+濃度改變

尹 楠，茹 峰，王東文*

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，山西太原 030001

目的：測定大鼠單側(cè)部分輸尿管梗阻后輸尿管平滑肌細(xì)胞中游離Ca2+濃度改變。方法：將Wistar雄性大鼠80只隨機(jī)分為4組：8周PUUO組20只，16周PUUO組20只，同期對照組各20只。PUUO組采用將大鼠左側(cè)上12段輸尿管包埋入腰大肌造成單側(cè)輸尿管部分梗阻的動物模型，對照組僅分離左側(cè)輸尿管。成模后分別于8周和16周分離取出輸尿管，分離單個輸尿管平滑肌細(xì)胞應(yīng)用Fura-2/AM熒光探針負(fù)載檢測輸尿管平滑肌細(xì)胞中游離Ca2+的濃度。結(jié)果：輸尿管平滑肌靜態(tài)細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光比值測定結(jié)果顯示：8周的PUUO大鼠組與對照組大鼠之間細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而16周的PUUO大鼠組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的濃度顯著升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：細(xì)胞內(nèi)鈣超載是輸尿管梗阻后平滑肌功能損害病理過程的重要原因，但是發(fā)生較晚，可能在輸尿管部分梗阻后期起著重要作用。

單側(cè)輸尿管部分梗阻（PUUO）；輸尿管平滑?。患?xì)胞內(nèi)鈣離子

鈣超載通過損傷細(xì)胞膜和線粒體，從而導(dǎo)致了細(xì)胞不可逆轉(zhuǎn)死亡。鈣離子作為胞內(nèi)重要的第二信使，是生存與死亡信號，幾乎我們所有的生理活動都受到鈣離子的調(diào)控。細(xì)胞胞漿內(nèi)游離鈣離子濃度是調(diào)節(jié)各種反應(yīng)的關(guān)鍵，胞內(nèi)存在各種復(fù)雜的鈣調(diào)控機(jī)制以保持它的平衡，所以它的實(shí)時定量檢測顯得十分必要[1]。本研究通過對細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化的測定，探討大鼠輸尿管平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子變化對于平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響，為進(jìn)一步闡明輸尿管部分梗阻對平滑肌細(xì)胞損傷的作用機(jī)制提供實(shí)驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 PUUO大鼠模型的建立及實(shí)驗分組[2-3]

（350±25）g Wistar雄鼠，隨機(jī)分為單側(cè)輸尿管部分梗阻（PUUO）組和對照組。將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射（0.3m l/100mg），仰臥位固定，作左側(cè)縱行切口長3～4 cm。仔細(xì)游離出左側(cè)輸尿管，在腰大肌腹側(cè)做一縱行切口，將左側(cè)輸尿管上12段腰大肌包埋于縱行切口中，在肌肉切口邊緣用3-0絲線縫合2針，造成輸尿管部分梗阻。對照組只將左側(cè)輸尿管分離，腰大肌做縱行切口。造模成功后于8周和16周腎盂壓力測定進(jìn)行模型驗證[4]，隨機(jī)選取實(shí)驗組大鼠，并與正常對照組大鼠匹配后分離輸尿管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定。

1.2 材料

Axiovert S100熒光顯微鏡 （德國Zeiss公司）；Axopatch 200B放大器（美國Acon Instruments公司）；離子成像系統(tǒng)（德國TILLPhotonics公司）；Fura-2/AM熒光探針（Biotium公司）；PBS；Ⅱ型膠原酶，牛血清白蛋白（Sigma公司）。氯化鉀、氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀、丙酮酸鈉、無水葡萄糖均為國產(chǎn)分析純試劑。

輸尿管平滑肌細(xì)胞的分離[5]：①PBS溶液的制備；②酶消化液：Ⅱ型膠原酶1 g/L，牛血清白蛋白1 g/L；③輸尿管平滑肌細(xì)胞的制備：將成模的大鼠用10%水合氯醛腹腔注射（0.3 ml/100 mg）麻醉后，迅速游離出左側(cè)輸尿管，標(biāo)本取出后于10%青霉素溶液中浸泡5min，再用PBS緩沖液沖洗3次，在自制平臺（在35mm培養(yǎng)皿中倒入PBS緩沖液，把濾紙剪成適當(dāng)大小鋪于培養(yǎng)皿中，利用濾紙的摩擦力固定輸尿管）上除去輸尿管周圍脂肪及表面結(jié)締組織，將輸尿管剪成肉糜后用PBS緩沖液沖洗至無血，將其置于EP管離心后，吸取上清PBS緩沖液后轉(zhuǎn)移至0.1%Ⅱ型膠原酶溶液中，在37℃環(huán)境下振蕩消化約3.5 h，當(dāng)消化液混濁，組織塊呈絮狀時提示消化良好，加入1 g/L牛血清白蛋白中止消化。反復(fù)吹打絮狀組織塊后靜置5min，吸出混懸液?；鞈乙弘x心（1 000 r／min，離心半徑13 cm）5min，沉淀的細(xì)胞移入培養(yǎng)皿中。

1.3 輸尿管平滑肌內(nèi)鈣離子濃度的測定

1.3.1 輸尿管平滑肌細(xì)胞的Fu r a-2/AM負(fù)載 將酶消化完畢的輸尿管平滑肌細(xì)胞用PBS緩沖液制成單細(xì)胞懸液，將單細(xì)胞懸液在顯微鏡下調(diào)整每毫中含細(xì)胞數(shù)約為106，加入濃度為5μmol/L的Fura-2/AM作為Ca2+的熒光指示劑，保持35℃45min，用PBS沖洗兩次備用。以上過程需避光。

1.3.2 輸尿管平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的測定 在倒置顯微鏡下選好進(jìn)行測定的細(xì)胞，510 nm為發(fā)射波長，以340 nm和380 nm為激發(fā)波長，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度（[Ca2+]c）的測定。具體來說，在激發(fā)熒光波長為340 nm左右時，結(jié)合物熒光強(qiáng)度上升；而在激發(fā)熒光波長為380 nm時，其熒光強(qiáng)度會下降；在Fura-2的等消光點(diǎn)360 nm時，其熒光強(qiáng)度與結(jié)合的Ca2+濃度無關(guān)。這樣，[Ca2+]c可以直接由兩個激發(fā)波長上的熒光強(qiáng)度的比值來計算，即雙激發(fā)波長熒光法。選擇對鈣離子不敏感的激發(fā)波長360 nm則可以用來反應(yīng)全細(xì)胞吸波后熒光染料擴(kuò)散進(jìn)細(xì)胞的過程以及監(jiān)視細(xì)胞內(nèi)熒光染料的總量變化的過程，具體計算公式如下：

其中Keff為有效結(jié)合常數(shù)，F(xiàn)1為波長340 nm激發(fā)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)2則為380 nm激發(fā)的熒光強(qiáng)度。R為F1與F2的比值，Rmin是在零鈣濃度下的最小熒光比值，Rmax則為在高鈣濃度（10mM）時的最大熒光比值[6]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件，計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表達(dá)，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

成模的40只大鼠中，16周實(shí)驗組和8周實(shí)驗組因感染、腸粘連等原因死亡和經(jīng)壓力測定篩選后分別有15只和16只完成實(shí)驗。16周和8周對照組分別有17只和18只完成實(shí)驗。

測定平滑肌細(xì)胞游離細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光比值結(jié)果示：在8周PUUO組的大鼠輸尿管平滑肌中Ca2+的平均熒光比值為（200.42±36.34），8 周對照組（187.63±23.51），8 周 PUUO 組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光比值高于同期對照，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），在16周PUUO組的大鼠輸尿管平滑肌中Ca2+的平均熒光比值為（454.92±31.69），16 周對照組（173.88±35.44），16周PUUO組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光比值明顯高于同期對照組（P＜0.05）。見圖 1、表 1。

表1 8周和16周平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度（熒光比值）的比較（±s）Tab.1 The com pares of cytosol-free calcium concentration in smooth muscle in 8 weeks and 16 weeks(±s)

表1 8周和16周平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度（熒光比值）的比較（±s）Tab.1 The com pares of cytosol-free calcium concentration in smooth muscle in 8 weeks and 16 weeks(±s)

注：與對照組比較，P＜0.05

對照組PUUO組組別 8周組187.63±23.51 200.42±36.34 16周組173.88±35.44 454.92±31.69

3 討論

近幾年來，盡管對于上尿路梗阻的研究取得了一定的進(jìn)展，但腎臟仍是研究重點(diǎn)。而本研究小組將梗阻的輸尿管作為研究對象，并在前期試驗中證實(shí)了PUUO模型中梗阻輸尿管肌條的收縮力和收縮頻率分別在不同梗阻時期的相應(yīng)變化[7]。因此，本實(shí)驗在分子水平上探討PUUO模型中游離Ca2+的變化，以期為輸尿管平滑肌功能學(xué)變化提供分子學(xué)依據(jù)。

分子機(jī)制決定了器官的形態(tài)和功能的變化，而形態(tài)的改變決定了其功能的變化，因此，對分子機(jī)制的研究顯得尤為重要。眾所周知，鈣是維持細(xì)胞正常功能、結(jié)構(gòu)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。在生理狀態(tài)下，胞漿內(nèi)鈣離子濃度約為10-7mol/L，而細(xì)胞外鈣濃度為胞內(nèi)鈣離子濃度的10 000倍。在正常生理情況下細(xì)胞通過其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制可保持這種巨大的濃度差，以維持胞內(nèi)低鈣狀態(tài)，但一些有害因素可使鈣離子平衡系統(tǒng)失調(diào)，導(dǎo)致鈣離子分布紊亂，最終細(xì)胞內(nèi)鈣濃度異常升高，即發(fā)生了鈣超載。鈣超載是通過以下兩方面引起細(xì)胞受損：①線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)體（PTP）的開放，PTP開放時許多大分子非選擇性地由胞漿向線粒體擴(kuò)散，導(dǎo)致線粒體膜電位的破壞和功能障礙，細(xì)胞內(nèi)鈣超載時，Ca2+也可與PTP相結(jié)合，導(dǎo)致線粒體腫脹，功能失調(diào)，均能引起細(xì)胞死亡[8]；②酶的激活，鈣蛋白酶活性增加并引起外鈣內(nèi)流，接著鈣蛋白酶從胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞上，從而引起Cl-內(nèi)流和細(xì)胞溶解死亡[9]。

本科研小組在前期試驗已證實(shí)在大鼠輸尿管梗阻后，8周時試驗組輸尿管平滑肌收縮力和收縮頻率與對照組相比均增加[7]，α1-AR及Gq/11與β-actin灰度比值顯著高于對照組，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義[10]。8周實(shí)驗組輸尿管肌條自律性收縮力增加，α1-AR及Gq/11與β-actin灰度比值高與大鼠自身的代償機(jī)制有關(guān)[10]。在無任何治療情況下，16周時，PUUO實(shí)驗組輸尿管平滑肌的收縮力和收縮頻率比對照組均降低[6]。α1-AR及Gq/11與β-actin灰度比值低于對照組，均表現(xiàn)為失代償。本實(shí)驗結(jié)果顯示在造模8周時，測定輸尿管平滑肌細(xì)胞內(nèi)靜息鈣離子熒光比值比正常差異略有增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)差異，這與PUUO大鼠輸尿管肌條收縮力增加的代償機(jī)制有關(guān)。梗阻發(fā)展到16周時,PUUO大鼠輸尿管平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子熒光比值與對照組大鼠相比出現(xiàn)明顯的改變，即細(xì)胞內(nèi)鈣超載的發(fā)生，對輸尿管平滑肌超微結(jié)構(gòu)與其收縮肌運(yùn)送尿液的功能進(jìn)一步損害，同時證實(shí)了前期大鼠輸尿管平滑肌功能試驗中16周PUUO實(shí)驗組比對照組收縮力和收縮頻率均降低的分子學(xué)機(jī)制。

PUUO發(fā)病過程中直接影響到輸尿管平滑肌細(xì)胞的能量代謝，通過對輸尿管平滑肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察證實(shí)：線粒體破壞導(dǎo)致的輸尿管平滑肌能量代謝是引起輸尿管平滑肌收縮功能的起因。能量代謝的紊亂使細(xì)胞膜上離子泵功能發(fā)生異常，破壞了輸尿管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子的相對穩(wěn)態(tài)，引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，導(dǎo)致輸尿管平滑肌超微結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步損害[11]。可見，細(xì)胞內(nèi)鈣超載是使輸尿管平滑肌功能受損害的重要原因，但由于其發(fā)生較晚，在輸尿管部分梗阻后期起著極其重要的作用。

通過對梗阻后輸尿管平滑肌功能改變的分子學(xué)機(jī)制的研究，使臨床工作中應(yīng)用鈣離子拮抗劑，為阻斷過多的鈣離子進(jìn)入細(xì)胞，延緩輸尿管平滑肌細(xì)胞受損，保證輸尿管平滑肌的收縮力，從而達(dá)到最大限度的輸送尿液，減少對腎臟排尿功能的損害提供了有力的證據(jù)。但對于其他影響輸尿管平滑肌功能的影響因素尚需后續(xù)實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)。

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Changes of cytosol-free calcium concentration in smooth muscle in partial unilateral ureteral obstruction rats

YINNan,RUFeng,WANGDongwen*
Department of Urology,the First Hospital,ShanxiMedical University,Shanxin Province,Taiyuan 030001,China

Objective:To observe the changes of cytosol-free calcium concentration in smooth muscle in partial unilateral ureteral obstruction rats.Methods:Eighty wistar rats had been divided into four groups by random:8-week experimental group(n=20)and sham control group(n=20);16-week experimental group(n=20)and sham control group(n=20).Experimental animals left ureters (n=40)had been embedded the upper half into the psoasmuscles.Sham control rats only

laparotomy after themodel arc established the rats were separated in different experimental point to carry out the intracellular calcium concentration weremeasured in single ureteral smooth muscle cell in rats using the fluorescent calcium indicator dye Fura-2/AM at rest situation.Results:The intracellular calcium concentration in single ureteral smooth muscle cell in PUUO rats had no significant difference in the initial stage at rest situation in comparison to sham control group [(200.42±36.34)vs (187.63±23.51)].However,at 16th week after onest,the intracellular calcium concentration in single ureteral smoothmuscle cell(454.92±31.69)was significantly increased in PUUO rats as compared with that in sham control group (173.88±35.44).Conclusion:Intracellular calcium overload occurres later than the dysbolism.Maybe intracellular calcium overload is an important factor in the progression of PUUO.

PUUO;Ureteral smoothmuscle;Intracellular calcium

Q81699

A

1673-7210（2011）03（b）-006-03

山西省國際科技合作項目（項目編號：2007081036）。*

2010-12-29）