盧會青 李曉光

(泰山醫(yī)學院附屬泰山醫(yī)院，山東 泰安 271000)

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管生成的關鍵因子，其表達與腫瘤生長、侵襲及轉移關系密切[1]。近年的研究[2]指出一氧化氮(nitric oxide，NO)作為重要的血管擴張劑，可刺激VEGF產生并參與VEGF促血管生成過程中的每一步驟。本研究檢測了涎腺粘液表皮樣癌VEGF、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達，以探討VEGF、iNOS和eNOS在涎腺粘液表皮樣癌的表達及其相關性；研究NO和 VEGF的相互作用及在促腫瘤生長中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料及切片制備

30例涎腺粘液表皮樣癌組織均取自我院1984年～2010年手術切除標本蠟塊，患者年齡27～72(平均51.7)歲，男11例，女19例，頸部淋巴結轉移與否以術后病理檢查結果為準。所有患者術前均未接受化療或放療，根據WHO的MEC分級標準[3]，高分化21例，低分化9例。其中大涎腺粘液表皮樣癌20例，小涎腺粘液表皮樣癌10例。有淋巴結轉移4例，無淋巴結轉移26例。蠟塊制備5 μm厚連續(xù)切片，分別用抗VEGF單克隆抗體和iNOS 、eNOS多克隆抗體進行免疫組織化學染色，并做常規(guī)HE染色。

1.2 免疫組織化學染色

第一抗體VEGF、iNOS、eNOS均為武漢博士德公司提供，3,3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)為Sigma公司產品，染色方法參照試劑盒說明按SABC法進行。分別用1.5%正常兔血清和0.01 mol/L PBS液取代第一抗體作為替代對照和空白對照。用己證實 VEGF、iNOS、eNOS染色陽性的乳腺癌切片作陽性對照。

1.3 VEGF、iNOS和eNOS的判斷標準

腫瘤細胞內出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，選擇每張切片組織和細胞形態(tài)保持完整的組織區(qū)域進行免疫組化染色判斷。根據紀小龍等[4]提供的免疫組化陽性判斷標準,結合全國免疫組化技術與診斷標準化專題研討會精神,按腫瘤細胞著色強度及陽性細胞比例,以10%以上細胞呈弱、中等強度陽性反應為標準,分為陽性及陰性。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS13.0軟件進行數(shù)據處理， VEGF、iNOS、eNOS蛋白表達間的關系用χ2檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 VEGF、iNOS和eNOS的表達

① 30例涎腺粘液表皮樣癌組織中，有20例(66.67%)表達VEGF， VEGF陽性物質主要位于癌細胞的胞膜或胞漿(圖1)，部分腫瘤血管內皮細胞及新生小血管內皮也呈陽性。②有21例(70%)表達iNOS，陽性顆粒主要見于癌細胞胞漿內，為棕黃色,大多數(shù)為均勻著色,有的表現(xiàn)為小顆粒狀(圖2)。③有24例(80%)表達eNOS，棕黃色癌細胞胞漿著色(圖3)。

圖1 VEGF陽性細胞漿內含有棕色顆粒(×400)

圖2 iNOS陽性細胞漿內含有棕色顆粒(×400)

圖3 eNOS陽性細胞漿內含有棕色顆粒(×400)

2.2 涎腺粘液表皮樣癌VEGF、iNOS和eNOS表達的相關性

VEGF表達與iNOS表達具有明顯的相關性(P<0.05，表 1)。VEGF表達與eNOS表達無明顯的相關性(P>O.05，表2)。

表1 30例涎腺粘液表皮樣癌組織VEGF表達與iNOS表達的關系[n(%)]

注：χ2=6.43，P<0.05。

表2 30例涎腺粘液表皮樣癌組織VEGF表達與eNOS表達的關系[n(%)]

注：χ2=0.94，P>0.05。

3 討 論

VEGF是血管生成過程中的關鍵因子，其過度表達與腫瘤生長、侵襲及轉移關系密切[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，催化一氧化氮生成的關鍵酶——一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性的增高與腫瘤血管生成關系密切。本研究中30例涎腺粘液表皮樣癌組織有20例(66.67%)表達VEGF，主要是癌細胞胞漿表達，VEGF表達具有明顯的異質性，染色強度較高的腫瘤細胞多位于浸潤前緣。腫瘤間質中也有散在分布的少數(shù)VEGF陽性的成纖維細胞。腫瘤血管內皮細胞也有部分表達VEGF，與癌巢較遠的血管則無VEGF表達，說明腫瘤細胞分泌的 VEGF通過旁分泌方式作用于血管內皮細胞。VEGF通過以下作用促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展：①通過與內皮細胞上的特殊受體作用，直接刺激內皮細胞分化增殖和遷移，促進血管構建及生成。②增強血管通透性。③參與免疫系統(tǒng)的調節(jié)，使腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。④誘發(fā)惡性腹水。⑤有研究[5]顯示 VEGF通過 VEGFR-2來維持內皮細胞的存活，VEGFR-2的抗體可促進內皮細胞凋亡。

許多腫瘤組織中 NOS的表達增加，提示 NOS的異常表達以及NOS的生成可能與這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關。本研究中表達iNOS的涎腺粘液表皮樣癌有21例(70%)，陽性顆粒主要見于癌細胞胞漿內，腫瘤間質中有部分巨噬細胞、肥大細胞也呈陽性。表達eNOS的有24例(80%)。NO可在腫瘤早期通過介導DNA損傷來參與復雜的癌癥形成過程，還可通過刺激腫瘤細胞的侵襲性、誘導血管生成和調節(jié)免疫系統(tǒng)來促進腫瘤的生長、侵襲和轉移[6]。有報道NOS活性的增高與腫瘤血管生成關系密切[2]，腫瘤血管生成與腫瘤組織局部NO濃度、腫瘤類型和腫瘤細胞對NO的敏感性有關。高NO產量的腫瘤細胞死亡，而產生少量NO或存在于低水平NO環(huán)境中的瘤細胞以及對NO殺傷作用不敏感的瘤細胞生存下來[6]。 Gallo等[7]對頭頸部腫瘤及以往對口腔癌[8-9]的研究結果亦提示NOS的表達與腫瘤血管生成及腫瘤發(fā)展密切相關。

NO促血管生成的作用機制尚不清楚，有研究報道表明，NO主要在 VEGF調節(jié)的血管生成過程中發(fā)揮作用，腫瘤細胞生成的 VEGF可增加內皮細胞生成NO[10-11]，增加內皮細胞NOS的活性[12〗。另有報道認為NO在VEGF促血管內皮細胞增殖和遷移中起重要作用[13-14]，而且NO還參與VEGF的促血管通透性的作用[15]。本研究結果顯示涎腺粘液表皮樣癌中iNOS的表達與VEGF的表達有關，提示有必要對NOS和VEGF的相互作用機制進一步研究，探討NO在VEGF促血管生成過程中所起的作用，從而提供更多有關腫瘤血管生成的生物學信息。

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