張 玲 王慶才

(1．泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，山東 泰安 271000； 2．泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 泰安 271000)

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,近年來發(fā)病呈上升趨勢,腫瘤的治療,除傳統(tǒng)的手術(shù)、化療和放療等手段外,利用生物制劑或進行基因治療正在成為一種新的治療策略。細(xì)胞凋亡[1-2]是一種程序性細(xì)胞死亡,是機體胚胎發(fā)育和組織更新過程中清除衰老及異常細(xì)胞的主要途徑。該過程受凋亡促進因子和凋亡抑制因子的共同調(diào)節(jié)，因此,系統(tǒng)的研究生物制劑對腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用及對凋亡相關(guān)基因的影響,對腫瘤的治療具有重要意義。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)[3-4]是TNF家族中誘導(dǎo)凋亡的分子之一,TRAIL通過與其特異性膜受體結(jié)合而誘導(dǎo)凋亡。本研究進一步探討TRAIL對胃癌細(xì)胞株MKN28細(xì)胞體外誘導(dǎo)凋亡的影響，為胃癌的治療提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株MKN28細(xì)胞購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI Medium 1640(Gibco, USA)培養(yǎng)基中,在5%C02,37℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，一般3～4天用0.25%胰酶消化傳代一次。

1.2試劑 TRAIL(美國Peprotech公司)；Caspase-3(中杉金橋)；Annexin V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(廣州長瑞生物技術(shù)有限公司)；兔SP檢測試劑盒(中杉金橋)；MTT( Sigma公司)。

1.3藥液的制備及分組 將人可溶性TRAIL稀釋到所需濃度,TRAIL終濃度分別為50 ng/ml，100 ng/ml，200 ng/ml，400 ng/ml，800 ng/ml，同時設(shè)置對照組。

1.4MTT實驗 取處于指數(shù)生長期的人胃癌細(xì)胞株MKN28細(xì)胞經(jīng)胰酶消化,配成懸液,用96孔細(xì)胞板,培養(yǎng)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，將藥液分別加入各孔,每個劑量重復(fù)4孔。然后孵育8 h,12 h,24 h,48 h,72 h后加入1 mg/ml的 MTT溶液，孵育1 h,使MTT還原為Formazan，吸出上清液,加入100 μl DMSO使Formazan溶解,混懸儀混勻后用酶標(biāo)儀在490 nm處測定OD值，計算抑制率(%)=(1-實驗組OD/對照組OD)×100%，形態(tài)學(xué)觀察用不同濃度的TRAIL處理人胃癌細(xì)胞株MKN28在倒置顯微鏡下形態(tài)變化,并攝影。

1.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將各濃度的TRAIL分別加入培養(yǎng)細(xì)胞至預(yù)定時間后,用0.25%胰蛋白酶消化，棄去消化液,加入PBS液;吸管吹打細(xì)胞，取約1×106個待測細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液，加入10 μl Annexin V-FITC和5～10 μl 碘化丙啶,混合均勻，孵育15 min;加入400 μl 1倍結(jié)合緩沖液,細(xì)胞上機檢測，利用流式細(xì)胞儀488 nm波長分析凋亡細(xì)胞，并設(shè)定PBS對照組。

1.6流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量 TRAIL蛋白處理過的MKN28細(xì)胞及對照組至預(yù)定時間后,經(jīng)PBS洗滌、離心后配成1×106/ml細(xì)胞懸液，過濾后單細(xì)胞懸液用75%冰乙醇固定于-20℃冰箱;去乙醇、離心、PBS清洗，制成細(xì)胞懸液;加入PI染液0.5 ml， 4℃避光染色30 min以上后過濾，上機檢測,用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞DNA結(jié)合PI的熒光強度,分析DNA含量和細(xì)胞周期。

1.7細(xì)胞免疫組化檢測Caspase-3的表達 將處于生長對數(shù)期的細(xì)胞按1×105個/孔接種于鋪有載玻片的6孔板, 細(xì)胞生長80%～90%融合時, 分組并將不同濃度的TRAIL分別加入培養(yǎng)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至預(yù)定時間后取出蓋玻片, 熒光顯微鏡下觀察拍照后用4%的多聚甲醛固定、清洗， 加3%H2O2后清洗，滴加抗體、清洗、脫水，透明，封片，鏡檢。

1.8AO/EB雙染色 分別收集經(jīng)TRAIL蛋白處理至預(yù)定時間的MKN28細(xì)胞及對照組細(xì)胞, 制備單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞密度后加入AO和EB混合液, 滴于載玻片, 蓋片封片后熒光顯微鏡直接觀察,熒光顯微鏡510 nm激發(fā)波長觀察。

2 結(jié) 果

2.1倒置顯微鏡觀察治療前后各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 治療前，在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，胃癌MKN28細(xì)胞呈貼壁生長，生長旺盛，治療后12 h、24 h、48 h、72 h觀察各組細(xì)胞有不同程度的變化，細(xì)胞部分變圓浮起，細(xì)胞間接觸變松，間距增寬，增殖變慢，細(xì)胞中顆粒增多，細(xì)胞周圍出現(xiàn)碎片。而且隨著TRAIL蛋白濃度的升高，這種變化越發(fā)明顯，出現(xiàn)大量碎片(圖1)。對照組變化不明顯(圖2)。

圖1 200ng/ml TRAIL作用后的MKN28細(xì)胞

圖2 對照組

2.2AO/EB雙染色結(jié)果 AO/EB染色及熒光顯微鏡觀察，不同濃度的TRAIL作用MKN28細(xì)胞后，出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變,并隨濃度和時間的增加而越發(fā)明顯，早期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小，胞核呈黃綠色，致密固縮濃染或碎片狀，胞膜尚完整，胞質(zhì)桔紅色；而晚期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為染色質(zhì)被EB染成橙色，呈固縮狀或圓珠狀；壞死細(xì)胞核染色質(zhì)也被EB染成橙色或紅色，但細(xì)胞核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)尚正常(圖3)?？瞻讓φ战M未經(jīng)TRAIL處理的正常活細(xì)胞核呈圓形，核染色質(zhì)被AO染成均勻一致的綠色或黃綠色，核染色質(zhì)呈正常結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖3 200ng/mlTRAIL作用后MKN28細(xì)胞

圖4 對照組

2.3MTT細(xì)胞增殖活性結(jié)果 TRAIL蛋白作用于胃癌MKN28細(xì)胞，隨著TRAIL濃度的增加，對細(xì)胞的抑制率增高，具有劑量依賴性； TRAIL蛋白治療組與空白對照組相比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)不同濃度TRAIL(50 ng/ml，100 ng/ml，200 ng/ml，400 ng/ml，800 ng/ml)處理MKN28細(xì)胞，MKN28細(xì)胞的凋亡率隨著濃度的增高而升高(圖5)，各實驗組與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5流式細(xì)胞儀檢測DNA含量及細(xì)胞周期結(jié)果 MKN28細(xì)胞經(jīng)TRAIL作用后，細(xì)胞被阻滯于G0/G1，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞分裂受到抑制，凋亡率增加，DNA含量圖可見在DNA細(xì)胞周期峰前有一個亞二倍體峰，經(jīng)凋亡程序軟件分析，確認(rèn)為凋亡峰(圖6)。

圖5 50ng/ml TRAIL作用于MKN28細(xì)胞凋亡率(Annexin V)

圖6 50ng/ml TRAIL作用于MKN28細(xì)胞凋亡率(DNA含量)

2.6Caspase-3的表達結(jié)果 Caspase-3免疫染色陽性結(jié)果為細(xì)胞漿內(nèi)棕黃著色(圖7～8)。

圖7 100ng/mlTRAIL作用后MKN28細(xì)胞caspase-3的表達

圖8 200ng/mlTRAIL作用后MKN28細(xì)胞caspase-3的表達

表1 不同濃度、時間TRAIL蛋白作用胃癌MKN28細(xì)胞的抑制率

3 討 論

目前研究認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生與基因密切相關(guān)，基因突變或基因表達失常是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵。這些變化包括：原癌基因的激活、腫瘤抑制基因的失活、凋亡調(diào)節(jié)基因及DNA修復(fù)基因的突變等。其中凋亡調(diào)節(jié)基因表達異常使細(xì)胞凋亡過程失去控制，在腫瘤形成過程中起著十分重要的作用。因此對凋亡相關(guān)基因及其表達產(chǎn)物與腫瘤關(guān)系的深入研究，在揭示腫瘤的發(fā)病機制、早期診斷、預(yù)防及治療腫瘤方面均具有重要意義。以細(xì)胞凋亡為研究手段，進一步探討腫瘤的發(fā)生機制，開發(fā)新的腫瘤治療藥物及治療方法是控制腫瘤的最好途徑[5]。

本實驗結(jié)合MTT和流式細(xì)胞儀結(jié)果，觀察研究TRAIL體外對胃癌MKN28細(xì)胞增殖抑制率及誘導(dǎo)凋亡的影響。實驗結(jié)果表明，不同濃度的TRAIL均能抑制胃癌MKN28細(xì)胞的增殖活性，對細(xì)胞生長的抑制呈時間和劑量依賴性?？梢耘袛郥RAIL在體外對胃癌MKN28細(xì)胞具有殺傷作用，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，其原理可能是啟動了Caspase介導(dǎo)的凋亡通道。目前研究認(rèn)為，許多抗癌因素充當(dāng)了凋亡的誘導(dǎo)因子，耐藥的形成主要與藥物觸發(fā)凋亡的能力下降有關(guān)，盡管不同的抗癌藥物有不同的細(xì)胞內(nèi)靶點，但誘導(dǎo)細(xì)胞毒性最終集中到一種共同通道，即誘導(dǎo)凋亡。而且藥物引起的細(xì)胞凋亡頻繁地由Caspase級聯(lián)介導(dǎo)，盡管許多抗癌藥物介導(dǎo)細(xì)胞凋亡最終依賴激活Caspase級聯(lián)信號[6-7]，但確切的分子機制尚不清楚。本研究也證實TRAIL誘導(dǎo)信號為凋亡誘導(dǎo)。其作用是放大了藥物的凋亡活性，這種效應(yīng)上調(diào)了關(guān)鍵酶Caspase-3的表達，延長了Caspase-3的半衰期并增強了其生物學(xué)活性，促進DR4[8-9]、DR5[8]的敏感功能，反饋性的加強了TRAIL誘導(dǎo)凋亡的活性，提高了TRAIL對腫瘤細(xì)胞的敏感性。初步實驗證實， TRAIL 蛋白能夠抑制體外培養(yǎng)的人胃癌MKN28細(xì)胞的生長、增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡； 對 TRAIL 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率上升。根據(jù)國內(nèi)外的相關(guān)實驗研究，結(jié)合本次的實驗結(jié)果，我們推測，TRAIL可能通過上調(diào)Caspase-3的表達進而影響人胃癌MKN28細(xì)胞的凋亡過程。而Caspase-3活性反饋性的加強了TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性。這對臨床減少抗癌藥物的用量，減少耐藥具有重要的應(yīng)用價值。

總之，本實驗對調(diào)亡相關(guān)基因的研究為胃癌的診斷及治療提供了新的思路。隨著對細(xì)胞凋亡基礎(chǔ)研究的進一步深入，將為胃癌治療提供科學(xué)依據(jù)，并且為發(fā)掘新的抗癌藥物拓寬研究領(lǐng)域。但是，尚有許多問題需進一步闡明，如多種組織細(xì)胞能自身分泌可溶性 TRAIL，實驗時應(yīng)同時檢測其表達水平并進一步探討DR4、DR5、Caspase-3蛋白水平的表達與mRNA表達的作用機制。以上問題如能進一步研究闡明，必將為腫瘤及其它與凋亡調(diào)控異常相關(guān)疾病的病因全面揭示提供重要線索。

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