全桂靜， 尹黎獻(xiàn)

(沈陽化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽110142)

低溫堿性蛋白酶是一類最適溫度為15℃，最適pH值為堿性的蛋白酶，主要應(yīng)用于加酶洗滌劑，在制革、絲綢等工業(yè)有廣泛的用途［1］.目前加酶洗滌劑中主要添加的是中溫堿性蛋白酶，其最適溫度一般都在50℃以上，而自來水的溫度一般都在30℃以下，洗滌時必須采用加熱的水，給日常生活造成不便.若洗衣粉中加入低溫蛋白酶，則可直接用自來水洗滌，既方便又節(jié)約能量.在能源緊缺的地區(qū)，一般都不會用溫水洗滌，添加低溫堿性蛋白酶的洗滌劑將有很好的應(yīng)用前景和市場潛力［2］.

微生物低溫堿性蛋白酶的研究主要在近20年，產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的微生物主要集中在一些極端環(huán)境中，如深海的水和泥，深海的魚和貝，以及冰川、高山、南極和北極的水和泥中，，主要有假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、異單胞菌屬(Alteromonas)等［3－5］.選育優(yōu)良生產(chǎn)菌株是提高低溫堿性蛋白酶產(chǎn)量、降低成本的主要條件.本文由性狀優(yōu)良的枯草芽孢桿菌出發(fā)［6－8］，選育低溫堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株，并對發(fā)酵條件進(jìn)行初步優(yōu)化.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，購于中國普通微生物學(xué)保藏中心，實(shí)驗(yàn)室傳代保藏.

1.1.2 培養(yǎng)基配方［2，9］

富集培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，牛肉膏5，pH=8.5.酪蛋白培養(yǎng)基(g/L):干酪素10，瓊脂20，pH=10.種子培養(yǎng)基(g/L):NaCl5，牛肉膏3，蛋白胨10，pH=7.2～7.4.發(fā)酵培養(yǎng)基(g/ L):蛋白胨5，酵母粉3，葡萄糖5，pH=8.5.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種誘變

用3 mL無菌水洗下培養(yǎng)24 h的枯草芽孢桿菌斜面上的細(xì)胞，倒入含玻璃珠的無菌三角瓶中充分振蕩將細(xì)胞打散，制成單細(xì)胞懸液.

將菌懸液置于無菌培養(yǎng)皿，在15 W紫外燈的誘變箱中誘變120 s［10］，加入3 mL加倍牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基混勻，用黑紙包裹培養(yǎng)皿，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，取菌懸液劃線于酪蛋白培養(yǎng)基平板上，于20℃下恒溫培養(yǎng)48 h.

1.2.2 菌種復(fù)篩

用接種環(huán)取一環(huán)初篩得到的菌株，接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃、180 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，進(jìn)行蛋白酶活力測定.

1.2.3 粗酶液活力測定

發(fā)酵液于低速離心機(jī)4 000 r/min離心10 min，去除細(xì)菌細(xì)胞，收集上清液作為粗酶液進(jìn)行酶活性測定.

低溫堿性蛋白酶活性采用紫外法測定［2，11］.對照氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出酪氨酸的量［12］.

酶活力的定義為20℃、pH=8.0條件下，每分鐘催化酪蛋白生成1 μg酪氨酸所需的酶量為一個單位U［11］.

1.2.4 低溫堿性蛋白酶生產(chǎn)條件的研究

營養(yǎng)條件研究:以常用糖類及無機(jī)、有機(jī)含氮化合物分別作為碳源和氮源，50 mL三角瓶中裝20 mL液體培養(yǎng)基按5%比例接種，在30℃，180 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，測定酶活.

發(fā)酵條件優(yōu)化:在確定營養(yǎng)條件基礎(chǔ)上，考察各種因素對低溫堿性蛋白酶生產(chǎn)的影響，以優(yōu)化發(fā)酵條件.

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，見表1.正交實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn):按以上正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最優(yōu)配比進(jìn)行發(fā)酵重復(fù)實(shí)驗(yàn).

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與討論

2.1 低溫堿性蛋白酶生產(chǎn)菌株的篩選

經(jīng)紫外誘變后得到10株產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的菌株，經(jīng)過5次傳代后得到4株性狀比較穩(wěn)定的菌株.液體發(fā)酵24 h，測定蛋白酶活力，結(jié)果見圖1.由圖1可知3號菌株產(chǎn)酶的能力最強(qiáng).選擇3號菌株作為出發(fā)菌株，將菌株編號為B.Sub 3.

圖1 初篩菌株的蛋白酶活力Fig.1 Proteases of early screening strains

2.2 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.2.1 碳源對產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基的碳源種類對產(chǎn)酶有一定的影響，不同碳源對產(chǎn)酶的影響見圖2.從圖2可以看出:以葡萄糖為碳源時發(fā)酵液的酶活力最高;以甘油為碳源時產(chǎn)酶量最低.

圖2 碳源對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of carbon source on the productivity of enzyme

2.2.2 氮源對產(chǎn)酶的影響

考察蛋白胨、硫酸銨、牛肉膏、硝酸鉀及酪素等不同含氮物質(zhì)對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖3.由圖3可知:不同氮源對產(chǎn)酶的影響不大，產(chǎn)酶的最佳氮源為蛋白胨，酪素次之，牛肉膏最低.

圖3 氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on the productivity of enzyme

2.2.3 pH值對產(chǎn)酶的影響

確定最佳碳源和氮源后，考察pH值對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖4.由圖4可以看出:pH值對菌株產(chǎn)酶的影響較大，產(chǎn)酶的最佳pH值為8.0，酶活可以達(dá)1 896 U/mL，在pH值為7.0時細(xì)菌的產(chǎn)酶最差，酶活僅為1 500 U/mL.在pH值為5.5～7之間時，酶活隨pH值的增大而減小，pH值在7～7.5時酶活隨著pH值的增大而增大，當(dāng)pH值達(dá)到8.5時，不適應(yīng)菌株的生長，所以酶活有所降低.

圖4 初始pH值對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of initial pH on the productivity of enzyme

2.2.4 溫度對產(chǎn)酶的影響

利用確定的培養(yǎng)基條件，接種后分別在20℃，25℃，30℃，35℃，40℃下發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后測定其酶活.結(jié)果見圖5.從圖5可以看出溫度對產(chǎn)酶的影響較大.產(chǎn)酶的最佳溫度為30℃，酶活為2 240 U/mL.在溫度為25℃時酶活最低，酶活為2 195 U/mL.

圖5 溫度對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of temperature on the productivity of enzyme

2.2.5 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

將上面確定的培養(yǎng)基分別置于30℃下?lián)u床培養(yǎng)20 h、22 h、24 h、26 h、28 h、30 h，測定其酶活，結(jié)果見圖6.由圖6可以得出產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵時間為28 h，發(fā)酵時間為30 h時酶活最低.發(fā)酵時間低于28 h，酶活隨著發(fā)酵時間的增大而增大，當(dāng)發(fā)酵時間高于28 h時，蛋白酶的酶活又降低.原因是發(fā)酵時間過少細(xì)菌還未達(dá)到穩(wěn)定期，處在延滯期或者指數(shù)期，細(xì)胞內(nèi)的初生代謝產(chǎn)物還未達(dá)到最大值，產(chǎn)酶量也未達(dá)到最大值.發(fā)酵時間過長，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，細(xì)菌將分解蛋白酶等物質(zhì)為其提供能量，細(xì)胞內(nèi)分解代謝大于合成代謝，導(dǎo)致酶活降低.

圖6 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of fermentation time on the productivity of enzyme

2.2.6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源，進(jìn)行4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)來確定最佳培養(yǎng)基，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示.

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

由表2可知，A2B2C3D2為優(yōu)化組合，酶活可達(dá)到2 120 U/mL;由極差R可以看出，培養(yǎng)基的初始pH值對產(chǎn)酶的影響最大，其次分別為蛋白胨濃度，裝液量，溫度.適合B.Sub 1發(fā)酵生產(chǎn)低溫蛋白酶的培養(yǎng)基配方為葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，pH=8.0;發(fā)酵條件為32℃，50 mL三角瓶裝液量為20 mL發(fā)酵32 h.

2.2.7 正交實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按上述正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)配比:0.5%的蛋白胨，pH=8.0，溫度為32℃，裝液量為20 mL/50 mL三角瓶，進(jìn)行4組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3.由表3可知:在此條件下蛋白酶的最高活力是2 231 U，最低的為2 149 U，說明選育得到的菌株性能比較穩(wěn)定.目前，低溫堿性蛋白酶的研究較少，與枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶［8］相比，發(fā)酵液的酶活力相當(dāng)或略高，具有深入研究的價值.

表3 正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the demonstration test about orthogonal test

3 結(jié)論

通過誘變篩選，共得到5株低溫堿性蛋白酶的生產(chǎn)菌株.利用250 mL搖瓶液體發(fā)酵完成復(fù)篩，得到產(chǎn)低溫堿性蛋白量最高的一株枯草芽孢桿菌，且將其命名為B.sub 3.該菌株的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為:葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，pH值為8.0;發(fā)酵條件為:50 mL三角瓶中裝20 mL液體培養(yǎng)基，接種比例為5%，培養(yǎng)溫度為32℃，培養(yǎng)時間為28 h，發(fā)酵液中低溫堿性蛋白酶活力可以達(dá)到2 231 U/mL.

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