蔣劍波,周志剛,彭丁棟

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,湖南吉首 416000;2.中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410083)

黃酮類化合物 (flavonoid)又稱黃酮體、黃堿素,是一類以 C6-C3-C6碳架為基本特征的低相對(duì)分子質(zhì)量多酚化合物,廣泛存在于自然界中,尤其是在植物界中分布最廣。研究表明,黃酮類化合物具有多種生物活性,尤其是其在臨床上治療心血管疾病的強(qiáng)心、擴(kuò)張冠狀血管、增加冠脈血流量、抗心律失常、降壓、降低血膽固醇等作用[1]被發(fā)現(xiàn)以來,在國(guó)內(nèi)外掀起了從各種植物中尋找和提取天然黃酮的熱潮。

20世紀(jì) 90年代以來,人們對(duì)竹葉的研究發(fā)現(xiàn)[2],竹葉提取物 (Ebl)具有良好的抗衰老、抗病毒及保護(hù)心腦血管、防治老年退行性疾病等生物學(xué)功效。且迄今尚未發(fā)現(xiàn)竹葉提取物中任何有毒、有害成分,其安全性大大高于含有有毒白果酸成分的銀杏提取物 (EGb)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),以碳苷黃酮為主的黃酮類化合物是竹葉提取物中的主要功能因子。碳苷黃酮與氧苷黃酮相比具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,不易被降解;能深入病灶部位,直接發(fā)揮療效;親水性增強(qiáng)等特點(diǎn),有利于藥品、食品、化妝品等的開發(fā)。因此,對(duì)竹葉中黃酮的研究與開發(fā)成為人們關(guān)注的重點(diǎn)。

慈竹〔Sinocalam us affinis(Rendle)McClure.〕系禾本科竹亞科慈竹屬喬木型竹類,稈高 5～10 m,徑4～8 cm,原產(chǎn)中國(guó),分布在云南、貴州、廣西、湖南、湖北、四川及陜西南部各地[3]。湘西地處湘、鄂、川、黔四省邊區(qū),亦有慈竹分布。以往國(guó)內(nèi)對(duì)慈竹的研究主要在其栽培技術(shù)與環(huán)境生態(tài)效應(yīng)[4-5]、竹材利用技術(shù)[6]等方面,對(duì)其化學(xué)成分的研究較少。近年來,黃世德[7]等研究了慈竹瀝的化學(xué)成分,王瓊[8]等研究了慈竹構(gòu)件和分株水平總黃酮含量的變化及可溶性糖的含量,余文[9]等以醇提法研究了慈竹葉片黃酮的提取工藝及在四川不同地區(qū)含量的差異。有關(guān)湘西慈竹葉中天然黃酮的提取及測(cè)定尚未見報(bào)道。本文以浸提 -回流法提取,以分光光度法測(cè)定,研究湘西慈竹中天然黃酮的含量及其在不同季節(jié)中的變化情況,以期為竹資源的開發(fā)利用,服務(wù)地方區(qū)域經(jīng)濟(jì)建設(shè)提供科學(xué)參考和依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與藥品

紫外可見光分光光度計(jì) (Lambda 6,美國(guó) PE公司),電熱恒溫干燥箱 (DHG-9071A,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),電子天平 (JA2003N,上海精密科學(xué)儀器有限公司),數(shù)顯恒溫水浴鍋 (HH-S1,金壇市萬華實(shí)驗(yàn)儀器廠),固體樣品粉碎機(jī) (XA-1,金壇市榮華儀器制造有限公司)索氏提取裝置;無水乙醇(AR),丙酮 (AR),無水乙醚 (AR),硝酸鋁 (AR),亞硝酸鈉 (AR),氫氧化鈉 (AR),蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣 (中國(guó)藥品生物制品檢定所),二次蒸餾水;慈竹葉 (采于湖南湘西吉首市砂子坳鄉(xiāng),經(jīng)本校資環(huán)學(xué)院劉世彪教授鑒定)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集和預(yù)處理

在竹林中隨機(jī)選擇 5叢生長(zhǎng)發(fā)育正常、生活環(huán)境較一致的慈竹叢,在每一竹叢中選擇直徑大小相同 (4～5 cm)的慈竹各 5株,從各個(gè)方位均勻采集無傷病蟲害竹葉,于 2009年春 (4月)、秋季 (10月)各采一次。將采集的新鮮竹葉洗凈、晾干,于 60℃左右烘干至恒重,粉碎,過 40目篩,于磨口瓶中密封干燥貯存。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品 50.0 mg,置于 50 mL燒杯中,加少量 70%乙醇使之完全溶解,轉(zhuǎn)入 50 mL容量瓶中,再用 70%乙醇定容至刻度,搖勻,得到1.0 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取 0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于 50 mL容量瓶中,各加 30%的乙醇至25 mL,然后加入 5%的亞硝酸鈉溶液 1.5 mL,搖勻,放置 6 min后,再加入 10%的硝酸鋁溶液 1.5 mL,搖勻,放置 6 min,加入 4%的氫氧化鈉溶液 20 mL,稀釋至刻度,搖勻,靜置 15 min。以不加蘆丁的試劑為空白,用紫外可見光分光光度計(jì)測(cè)定 510 nm處的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 慈竹葉天然黃酮提取條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

固定料液比為 1∶20,選定溶劑、溶劑濃度、水浴溫度、加熱 (回流)時(shí)間 4個(gè)條件因素,按正交表L9(34)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),見表1。

表1 提取條件正交試驗(yàn)表

1.2.4 慈竹葉天然黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取 5.0 g干燥慈竹葉樣品,裝入提取器中,分別按 1.2.3節(jié)中條件提取慈竹葉總黃酮,每次加熱回流至樣品瓶中液體為無色。為使實(shí)驗(yàn)具有比較性,將每次提取步驟統(tǒng)一為:干燥粉碎竹葉 5.00 g→浸泡 (料液比 1∶20)→加熱回流→冷卻→抽濾→分離葉綠素→抽濾→濾液定容 (250 mL)。

1.2.5 慈竹葉總黃酮的測(cè)定

吸取溶液 10.0 mL于 50 mL容量瓶,在 1.2.3節(jié)正交試驗(yàn)得出的優(yōu)化提取條件下,按 1.2.2節(jié)方法測(cè)定樣品,并按回歸方程計(jì)算樣品總黃酮含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

用 Excel2003軟件分析處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

測(cè)得不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)的吸光度見表2。以濃度 C為橫坐標(biāo),吸光度 A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:A=10.553C+0.0032,相關(guān)系數(shù) R=0.999 8,RSD=0.15%(n=3)。

表2 不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)的吸光度

2.2 慈竹葉天然黃酮提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果及提取優(yōu)化條件

慈竹葉天然黃酮提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析方法[10],通過比較四種因素不同水平間的極差 (R)和同一因素不同水平的 K值大小,可以得出,四種因素對(duì)提取效果影響大小依次為:A(溶劑)>B(溶劑濃度)>D(回流時(shí)間)>C(水浴溫度),其中溶劑及其濃度是主要因素,回流時(shí)間和水浴溫度是次要因素;A2B1D3C2為提取優(yōu)化條件,即用浸提 -回流法提取湘西慈竹葉的最佳提取條件是 75%的丙酮于 70℃時(shí)回流加熱4小時(shí)。前一結(jié)論與文獻(xiàn)[11-12]等的結(jié)論相吻合或相接近,說明這一結(jié)論對(duì)于用溶劑 -回流法提取竹葉黃酮具有一定的普遍性。后一結(jié)論則與有關(guān)文獻(xiàn)有所區(qū)別。值得指出的是,在實(shí)際生產(chǎn)提取工藝中,為了降低能耗,提高效率,當(dāng)然希望加熱時(shí)間較短為好,但本文希望得到湘西慈竹葉中總黃酮量的準(zhǔn)確值,因此仍選擇加熱回流 4 h為最佳條件。

2.3 四種因素對(duì)慈竹葉總黃酮提取的影響

2.3.1 溶劑對(duì)慈竹葉總黃酮提取的影響

3種溶劑 (乙醇、丙酮、乙醚)對(duì)慈竹葉總黃酮提取的影響如圖1所示。圖1表明,固定其它因素不變,不同溶劑對(duì)慈竹葉總黃酮提取效果影響大小順序?yàn)楸?(k2A)>乙醇 (k1A)>乙醚 (k3A)。許鋼[11]比較了乙醇、甲醇、丙酮水浴和超聲提取淡竹葉中總黃酮的效果,其影響大小順序均為丙酮 >乙醇 >甲醇,袁珂[12]以乙醇、甲醇、丙酮索氏法提取高節(jié)竹葉中總黃酮時(shí),也得到了同樣的結(jié)果。本文的結(jié)果為上述文獻(xiàn)提供了佐證。同時(shí),目前關(guān)于竹葉黃酮提取的文獻(xiàn)中,以報(bào)道單一溶劑 (如乙醇)不同濃度對(duì)提取效果影響的居多,對(duì)不同溶劑對(duì)提取效果影響報(bào)道較少,本文研究表明乙醚對(duì)提取效果影響低于丙酮和乙醇,這一結(jié)果或許對(duì)今后竹葉黃酮提取溶劑選擇有一定參考價(jià)值。

圖1 不同溶劑對(duì)慈竹葉總黃酮提取的影響

2.3.2 溶劑濃度慈竹葉總黃酮提取的影響

同一溶劑不同濃度對(duì)慈竹葉總黃酮提取的影響見圖2。結(jié)果顯示,固定其它因素不變,當(dāng)溶劑濃度從 50%向 75%變化時(shí),慈竹葉總黃酮提取量隨濃度升高而增加,當(dāng)溶劑濃度從 75%向 100%變化時(shí),慈竹葉總黃酮提取量隨濃度升高而呈下降趨勢(shì)。這一變化趨勢(shì)與多數(shù)竹葉黃酮提取文獻(xiàn)的結(jié)果是相一致的,表明在提取竹葉黃酮時(shí),欲獲得較高的提取量,需要有機(jī)溶劑和水的配合,在有機(jī)溶劑與水的共同作用下進(jìn)行提取;而最佳提取效果,則與有機(jī)溶劑和水的比例有關(guān)。在本文中以 75%的溶劑濃度為最佳。

圖2 不同溶劑濃度對(duì)慈竹葉總黃酮提取的影響

2.3.3 水浴溫度對(duì)慈竹葉總黃酮提取的影響

水浴溫度對(duì)慈竹葉總黃酮提取影響的變化趨勢(shì)見圖3。圖3顯示,固定其它因素不變,當(dāng)水浴溫度從 50℃向 70℃變化時(shí),竹葉總黃酮的提取量隨溫度升高而升高,當(dāng)水浴溫度從 70℃向 80℃變化時(shí),竹葉總黃酮的提取量隨溫度升高而呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。這表明,慈竹總黃酮的提取量大小與水浴溫度相關(guān),在 50℃至 80℃范圍,存在一個(gè)最佳溫度,使得慈竹總黃酮提取量達(dá)最佳值。本文得到的最佳溫度是70℃。

圖3 水浴溫度對(duì)慈竹葉總黃酮提取的影響

2.3.4 加熱時(shí)間對(duì)慈竹葉總黃酮提取的影響

加熱時(shí)間對(duì)慈竹葉總黃酮提取影響的變化趨勢(shì)如圖4所示。圖4顯示,固定其它因素不變,當(dāng)加熱時(shí)間從 2 h向 3 h變化時(shí),慈竹葉總黃酮的提取量會(huì)略有下降,而當(dāng)加熱時(shí)間從 3 h向 4 h變化時(shí),總黃酮提取量有所增加,這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)[13]的報(bào)道相類似。而文獻(xiàn)[14]的研究表明,當(dāng)提取時(shí)間為 4.5 h時(shí),竹葉總黃酮提取量會(huì)趨于下降。故在測(cè)定時(shí)選擇加熱提取時(shí)間為 4 h。

圖4 加熱時(shí)間對(duì)慈竹葉總黃酮提取的影響

2.4 不同季節(jié)湘西慈竹葉黃酮的含量

稱取春、秋季竹葉粉末各 3份,均為 5.0 g,于20倍原料重 75%丙酮溶液 70℃條件下水浴冷凝回流 4 h,至浸提溶劑為無色,脫葉綠素后定容測(cè)定總黃酮的含量,吸光度和計(jì)算結(jié)果見表4。

表4 湘西慈葉中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明,春季 (4月)新生竹葉中黃酮含量平均為 13.0 mg·g-1,秋季 (10月)老葉中黃酮含量平均為 12.4 mg·g-1。王瓊[8]對(duì)四川南充慈竹構(gòu)件和分株水平總黃酮含量的變化研究發(fā)現(xiàn),慈竹葉總黃酮含量隨著月份變化呈現(xiàn)明顯的節(jié)律性變化:總黃酮含量 1～3月較低,在 4月?lián)Q葉期達(dá)到最大值,以后便迅速下降,5月份出現(xiàn)第一個(gè)低谷,6、7月黃酮類化合物略有增加,8月再次降低,進(jìn)入 9月后又開始回升,到次年 3月都維持在較高的水平,并且最高點(diǎn) 4月的總黃酮含量可達(dá) 17.7529 mg·g-1。本文測(cè)得的湘西慈竹葉總黃酮含量略低于四川南充慈竹葉,但兩者處于同一數(shù)量級(jí),并且春季新葉中黃酮含量略高于秋季老葉,這與文獻(xiàn)結(jié)果是相一致的。

3 結(jié) 論

3.1 固定料液比為 1∶20,選定溶劑、溶劑濃度、水浴溫度、加熱 (回流)時(shí)間 4個(gè)條件因素,按正交表L9(34)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),通過正交試驗(yàn),獲得浸提 -回流法提取湘西慈竹葉中黃酮類化合物的優(yōu)化提取條件是:以 75%的丙酮為浸提劑,于 70℃下回流加熱4 h。

3.2 研究發(fā)現(xiàn),溶劑、溶劑濃度、水浴溫度、加熱(回流)時(shí)間四種因素對(duì)提取效果影響大小依次為:A(溶劑)>B(溶劑濃度)>D(回流時(shí)間)>C(水浴溫度),其中溶劑及其濃度是主要因素,回流時(shí)間和水浴溫度是次要因素。不同溶劑對(duì)慈竹葉總黃酮提取效果影響大小順序?yàn)楸?>乙醇 >乙醚。

3.3 在優(yōu)化提取條件下,測(cè)得湘西慈竹葉總黃酮含量為 13.0 mg·g-1(春 )～12.4 mg·g-1(秋 ),春季新葉中黃酮含量略高于秋季老葉。湘西慈竹葉總黃酮含量略低于四川南充慈竹葉。

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