樊秋平，梁嘉碧，楊海云，郭新銘，羅葆明，吳傳斌

（1.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州市 510006；2.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院，珠海市 519000；3.中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣州市 510120）

熱療用阿霉素溫敏納米粒的制備及工藝優(yōu)化Δ

樊秋平1＊，梁嘉碧2，楊海云3，郭新銘2，羅葆明3，吳傳斌1#

（1.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州市 510006；2.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院，珠海市 519000；3.中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣州市 510120）

目的：制備熱療用阿霉素溫敏納米粒，并對其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法：合成兩親性溫敏嵌段共聚物P（NIPAM-co-DMAAM）-b-PCL，在水溶液中自組裝形成溫敏納米粒。用滴注法制備載藥溫敏納米粒，以包封率為評價(jià)指標(biāo)，通過正交設(shè)計(jì)對溫敏納米粒制備工藝中溫敏嵌段共聚物的濃度（A）、水相中阿霉素的濃度（B）、攪拌時(shí)間（C）等因素進(jìn)行優(yōu)化，對優(yōu)化后工藝進(jìn)行驗(yàn)證并在4℃下貯存90d考察其穩(wěn)定性。結(jié)果：合成了兩親性溫敏嵌段共聚物，其最低臨界溶解溫度（LCST）為40.3℃；最佳工藝為A0.15mg·mL－1、B 0.045mg·mL－1、C 1h，3批制劑的平均包封率為41.9%，平均粒徑（155±2.7）nm；90d內(nèi)制劑外觀、粒徑和包封率無明顯變化。結(jié)論：成功制備了阿霉素溫敏納米粒，且其制備工藝可行，質(zhì)量穩(wěn)定。

阿霉素；溫敏納米粒；制備；正交設(shè)計(jì)；包封率；穩(wěn)定性

熱療是將腫瘤區(qū)或全身加熱至有效治療溫度范圍并維持一定時(shí)間以殺滅腫瘤細(xì)胞的一種方法，作為腫瘤綜合治療的一個(gè)重要手段，在臨床上被廣泛用于實(shí)體腫瘤的治療。熱療分為局部熱療和全身熱療[1]，射頻消融（RFA）屬于局部熱療的一種方式，目前是肝癌非手術(shù)治療的主要手段，但是RFA無論應(yīng)用于“大肝癌”還是“小肝癌”都存在局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的問題[2]。如果能通過化療方法聯(lián)合RFA進(jìn)一步殺死殘存的癌細(xì)胞，便可降低局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移問題。阿霉素（ADM）是臨床常用的抗腫瘤藥物，但其心臟、腎臟毒性大，治療指數(shù)低，從臨床應(yīng)用的角度來看，應(yīng)尋找一種更有效的制劑，以最大限度提高腫瘤組織內(nèi)的藥物濃度，最大限度地降低心臟和腎臟藥物濃度（低毒性）[3]。聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）類溫敏藥物載體由于其設(shè)計(jì)的多樣性、最低臨界溶解溫度（LCST）的可調(diào)性，且具有被動靶向能力和定位釋放等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于藥物控釋系統(tǒng)中[4]。鑒于上述臨床需求和綜合考慮，本研究制備了可以作為阿霉素載體的溫敏納米粒，為下一步開展阿霉素溫敏納米粒聯(lián)合RFA治療原發(fā)性肝癌研究奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

SP131320-33Q磁力攪拌熱盤（美國Thermo公司）；BS224S電子天平（德國賽多利斯公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科儀公司）；400Mde核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；UV-1800紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；HP1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；LGJ-10C冷凍干燥機(jī)（長沙湘儀集團(tuán)）；5810R超低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorff公司）；BS5510DTH超聲波清洗器（上海生析超聲儀器有限公司）；Zetasizer Nano ZS90馬爾文納米粒度分析儀（英國馬爾文公司）。

鹽酸多柔比星（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號：1004E1，純度：＞98%）；N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM，日本TCI公司，批號：44A8A，純度：＞98.0%）；N，N-二甲基丙烯酰胺（DMAAM，美國Alfa Aesar公司，批號：J25S041，純度：＞99.5%）；偶氮二異丁腈（AIBN）、β-巰基乙醇（2-ME）、辛酸亞錫、ε-己內(nèi)酯、甲苯、無水乙醚等均為分析純；阿霉素溫敏納米粒（中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院研制）。

2 方法與結(jié)果

本試驗(yàn)先通過2個(gè)步驟合成了兩親性溫敏嵌段共聚物P（NIPAM-co-DMAAM）-b-PCL，并對其結(jié)構(gòu)和溫敏特性進(jìn)行表征。兩親性溫敏嵌段共聚物在水中可自主裝成納米粒，再通過滴注法制備了載藥納米粒，用正交設(shè)計(jì)對溫敏納米粒的處方進(jìn)行優(yōu)化，并對納米粒的粒徑分布等進(jìn)行表征。

2.1 兩親性溫敏嵌段共聚物P（NIPAM-co-DMAAM）-b-PCL的合成和表征

2.1.1 溫敏聚合物P（NIPAM-co-DMAAM）-OH的合成。參照文獻(xiàn)[5]中的采用自由基聚合反應(yīng)的方法。用AIBN為引發(fā)劑、2-ME為鏈增長劑進(jìn)行反應(yīng)。具體步驟如下：將一定量的NIPAM、DMAAM溶解在30mL的四氫呋喃中，加入適量的AIBN和2-ME，70℃條件下反應(yīng)12h。整個(gè)反應(yīng)過程在氬氣保護(hù)下進(jìn)行。用無水乙醚沉淀產(chǎn)物，沉淀物用少量的四氫呋喃（THF）復(fù)溶，再用無水乙醚沉淀，如此反復(fù)2次，所得產(chǎn)物在真空干燥箱（40℃）中干燥48h。

2.1.2 兩親性溫敏嵌段共聚物P（NIPAM-co-DMAAM）-b-PCL的合成。參照文獻(xiàn)[5]的方法，利用端基羥基轟擊己內(nèi)酯開環(huán)反應(yīng)合成此嵌段共聚物。具體操作如下：取溫敏聚合物P（NIPAM-co-DMAAM）-OH和一定量的ε-己內(nèi)酯，在催化劑辛酸亞錫條件下，140℃反應(yīng)24h，整個(gè)反應(yīng)過程在氬氣保護(hù)下進(jìn)行。反應(yīng)產(chǎn)物用過量乙醚沉淀，沉淀物用THF復(fù)溶后，再用乙醚沉淀，重復(fù)2次，所得產(chǎn)物在真空干燥箱（40℃）中干燥48h。

2.1.3 溫敏嵌段共聚物的結(jié)構(gòu)表征。用核磁共振波譜儀對上述 合 成 的 聚 合 物 P（NIPAM-co-DMAAM）-OH、P（NIPAM-co-DMAAM）-b-PCL進(jìn)行結(jié)構(gòu)特征的鑒定，其核磁共振（1H-NMR）圖譜詳見圖1。

圖1 1H-NMR圖譜Fig1 1H-NMR spectra

圖1A中由于用重水作溶劑，-OH上的活潑氫被交換，其質(zhì)子峰消失，而在δ＝4.7ppm處出現(xiàn)與HOD相應(yīng)的單峰，表明端基羥基被連接上。圖1B中，δ＝4.7ppm的峰消失，而在1～4ppm之間，出現(xiàn)眾多的多重峰，進(jìn)行峰歸屬為聚合物中飽和烴基—CH3、—CH2—、—CHCO的峰，表明ε-己內(nèi)酯開環(huán)而引入了大量的飽和烴基。結(jié)構(gòu)表征表明成功合成了溫敏兩親嵌段共聚物P（NIPAM-co-DMAAM）-b-PCL。

2.1.4 溫敏嵌段共聚物的LCST的測定。PNIPAM類溫敏共聚物水溶液隨著溫度的變化會出現(xiàn)相轉(zhuǎn)變，此轉(zhuǎn)變溫度成為最低臨界溶解溫度，即LCST。當(dāng)溫度低于LCST時(shí)，聚合物分子呈現(xiàn)溶解特性；當(dāng)環(huán)境溫度升至其LCST以上時(shí)，聚合物呈現(xiàn)出疏水特性發(fā)生皺縮，導(dǎo)致聚合物溶液由透明變成渾濁。文獻(xiàn)[6]中常用濁度法、以LCST為指標(biāo)來測量兩親溫敏嵌段共聚物的溫敏特性，具體方法如下：制備適量濃度為0.1mg·mL－1的P（NIPAM-co-DMAAM）-b-PCL水溶液，將其置于恒溫（30～50℃）水浴中，溫度每升高1℃平衡10min，用紫外可見分光光度計(jì)在500nm波長處測其透光率（T），透光率為50%時(shí)的溫度為其LCST。測定結(jié)果詳見圖2。

圖2 溫敏嵌段共聚物的溫度-透光率曲線Fig2 Curve of temperature-transmittancy of thermosensitive block copolymer

從圖2上可以看出，當(dāng)環(huán)境溫度從30℃升至39℃期間，聚合物溶液的透光率幾乎無變化；當(dāng)溫度在40～41℃時(shí)，聚合物溶液的透光率急劇下降。因此，得到聚合物的LCST在40～41℃之間，約為40.3℃。

2.2 阿霉素溫敏納米粒的制備

用滴注法制備阿霉素溫敏納米粒。方法如下：取一定量溫敏嵌段共聚物分散至5mL THF中，超聲直至完全溶解后，滴加至100mL含藥（阿霉素）溶液中。邊滴加邊攪拌，攪拌一定時(shí)間后即得阿霉素溫敏納米粒的混懸液。將混懸液轉(zhuǎn)移至透析袋中（Mw：3500），用蒸餾水透析2d（換液6次，每次1000mL），除去未包封的藥物和THF，透析完后冷凍干燥，即得載藥微粒粉末，密封后于4℃冰箱中存放。

2.3 含量測定方法

2.3.1 色譜條件。色譜柱：Agilent Zorbax ODS-C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：5mol·L－1H3PO4水溶液-乙腈-甲醇-異丙醇（65%∶15%∶10%∶10%）；選用熒光檢測器，檢測波長：激發(fā)波長505nm，發(fā)射波長550nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL。2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。標(biāo)準(zhǔn)液的制備方法：按照“2.2”項(xiàng)下的制備方法，制備空白納米粒混懸液，離心（12000r·min－1）30min后取上清液，用離心后的溶液作溶劑，精密制備一系列濃度的阿霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μg·mL－1，進(jìn)樣測定其峰面積（Y），以相應(yīng)的Y對其溶液濃度（X，μg·mL－1）進(jìn)行線性回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y＝0.0011X+0.0227（R2＝0.9996），結(jié)果表明阿霉素檢測濃度線性范圍為0.05～10μg·mL－1。

2.3.3 回收率試驗(yàn)。按照“2.3.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法制備高、中、低（10、1、0.05μg·mL－1）3個(gè)濃度的阿霉素樣品，每個(gè)濃度5個(gè)樣品。與隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線同法測定，每個(gè)樣品分析測定1次，測定結(jié)果用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算樣品的濃度，并以測定值平均值與制備的理論濃度值比較，即為回收率，結(jié)果平均回收率為98.4%（RSD＝1.92%）。

2.3.4 精密度試驗(yàn)。分別制備高、中、低（10、1、0.05μg·mL－1）3個(gè)濃度的阿霉素標(biāo)準(zhǔn)液，于同日內(nèi)測量，每種濃度連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算批內(nèi)精密度；連續(xù)測量5d，每日進(jìn)樣測量1次，計(jì)算批間精密度。結(jié)果批內(nèi)RSD小于1.02%，批間RSD小于1.97%。

2.4 包封率測定

采用高速離心法測定阿霉素納米粒的包封率：取一定量的阿霉素溫敏納米?；鞈乙?，離心（12000r·min－1）30min，取上清液，上清液中的藥物即為未包封藥物。按照“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，按照以下公式計(jì)算包封率：

2.5 阿霉素溫敏納米粒制備工藝的優(yōu)化

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，對影響包封率的3種主要因素：溫敏嵌段共聚物（以下簡稱共聚物）的濃度（A，mg·mL－1）、水相中阿霉素的濃度（B，mg·mL－1）、攪拌時(shí)間（C，h）進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，每個(gè)因素3個(gè)水平，采用正交表L9（34），以包封率為評價(jià)指標(biāo)來進(jìn)行工藝優(yōu)化。因素水平見表1，工藝優(yōu)化的正交設(shè)計(jì)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平表Tab1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab2 Result of orthogonal experiments

表3 方差分析Tab3 Analysis of variance

對包封率進(jìn)行方差分析可以看出，3種因素A、B、C均有顯著性差異，再結(jié)合直觀分析，確定最佳制備工藝為A2B3C1，即共聚物濃度為0.15mg·mL－1，水相中阿霉素濃度為0.045mg·mL－1，攪拌時(shí)間為1h。

2.6 工藝驗(yàn)證

按“2.2”項(xiàng)下方法及選定的工藝條件制備溫敏納米粒3批，測定其包封率，結(jié)果分別為40.8%、43.2%、41.6%，平均包封率為41.9%。

2.7 阿霉素溫敏納米粒的粒徑和穩(wěn)定性

2.7.1 載藥納米粒粒徑測定。取阿霉素溫敏納米?；鞈乙哼m量，用納米粒度分析儀測定其粒徑，結(jié)果粒徑分布較窄，粒徑均勻，平均粒徑為（155±2.7）nm，詳見圖3。

圖3 阿霉素溫敏納米粒的粒徑分布圖Fig3 Particle size distribution ofAdriamycin nanoparticles

2.7.2 阿霉素溫敏納米粒穩(wěn)定性觀察。將制備的樣品于4℃冰箱中保存3個(gè)月（90d），取出考察其外觀、粒徑和包封率的變化。結(jié)果，4℃儲存條件下，阿霉素溫敏納米粒外觀仍呈現(xiàn)均一、透明的分散體系，粒徑和包封率也變化不大，由此看出阿霉素溫敏納米粒具有良好穩(wěn)定性，詳見表4。

表4 樣品穩(wěn)定性結(jié)果Tab4 Stability of samples

3 討論

PNIPAM是一類被廣泛研究的溫敏材料，其聚合物相變溫度約32℃，當(dāng)與其他親水或疏水單體共聚合時(shí)可得到具有不同LCST的高分子：NIPAM與親水性單體（DMAAM、HEMA等）共聚可以提高LCST[7]。在本研究中，為了得到LCST高于人體生理溫度（37℃）的溫敏共聚物，讓NIPAM與一定比例的DMAAM共聚，最終通過調(diào)節(jié)比例使共聚物的LCST提高到40.3℃。通過加入不同比例的DMAAM，可以得到不同LCST的溫敏共聚物，與參考文獻(xiàn)[7]中的結(jié)論相符。

納米粒的制備方法主要有透析法、溶劑蒸發(fā)法和滴注法等。本文采用的是滴注法，該方法簡單易行，且所制備的納米粒粒徑均勻，粒徑分布為（155±2.7）nm，平均包封率為41.9%，室溫放置比較穩(wěn)定。

國內(nèi)、外對納米粒中藥物包封率的測定大多采用葡聚糖凝膠過濾法和超速離心法[8，9]，前者較費(fèi)時(shí)且效果不好，因此，本研究采用超速離心法測定納米粒的包封率。考慮到高速離心過程中可能導(dǎo)致納米粒中藥物泄露和空白囊材的干擾等，在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，用離心過的空白囊材溶液作溶劑來制備標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對此法的回收率進(jìn)行考察，多次測量后平均回收率為98.4%，RSD為1.92%。方法學(xué)結(jié)果表明此方法比較穩(wěn)定，可以用來測定阿霉素溫敏納米粒的包封率。

惡性腫瘤的綜合治療已成為大勢所趨，如聯(lián)合化療和熱療，二者聯(lián)合具有協(xié)同效應(yīng)。本研究合成的溫敏納米粒的LCST為40.3℃，而在人正常體溫下（37℃），由于環(huán)境溫度低于其LCST，藥物被包裹在載體中，當(dāng)局部通過熱療加熱使溫度高于其LCST（40.3℃）時(shí)，可使局部（加熱部位）藥物釋放增加，而不引起藥物在其他部位的釋放。熱療聯(lián)合藥物化療理論上可以增加惡性腫瘤治愈率，降低全身的毒副作用，但是有關(guān)其聯(lián)合RFA時(shí)藥物控釋特性和相關(guān)動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，成功制備了阿霉素溫敏納米粒，且其制備工藝可行，質(zhì)量穩(wěn)定。

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Preparation of Adriamycin Thermosensitive Nanoparticles for Hyperthermia Therapy and Optimization of Preparation Technology

FAN Qiu-ping，WU Chuan-bin
（School of Pharmacy，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China）
LIANG Jia-bi，GUO Xin-ming
（The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Zhuhai 519000，China）
YANG Hai-yun，LUO Bao-ming
（The Second Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China）

OBJECTIVE：To prepare Adriamycin thermosensitive nanoparticles for hyperthermia therapy，and to optimize the preparation technology of it.METHODS：Amphiphilic block copolymer poly（N-isopropyl-acrylamide-co-N，N-dimethylacrylamide）-b-poly（ε-caprolactone）was synthesized.Owing to their amphiphilic characteristics，the block copolymer formed self-assembled thermosensitive nanoparticles in aqueous milieus.Nanoparticles were prepared using solvent injection method.The preparation technology of nanoparticles was optimized by orthogonal experiments using encapsulation efficiency as index with the concentration of thermosensitive polymer（A），the concentration of adriamycin in water phase（B）and stirring time（C）as factors.Optimized formula was validated and the stability of nanoparticles stored at 4℃ for 90days was investigated.RESULTS：The amphiphilic block copolymer was synthesized.And its lower critical solution temperature（LCST）was around 40.3℃.Optimal formula was as follows：A of 0.15mg·mL－1，B of 0.045mg·mL－1，C of 1h.The average encapsulation efficiency were 41.9%and the mean diameters of nanoparticles were（155±2.7）nm.The appearance，particle size and encapsulation efficiency of nanoparticles had no significant change within 90days.CONCLUSION：Adriamycin thermosensitive nanoparticles have been prepared successfully，and preparation technology is feasible and stable in quality.

Adriamycin；Thermosensitive nanoparticles；Preparation；Orthogonal experiment；Encapsulation efficiency；Stability

R943；R979.1

A

1001-0408（2011）17-1580-04

Δ國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30872996）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009B030801081）

＊碩士研究生。研究方向：藥物新劑型和新技術(shù)。E-mail：fqpby2004@163.com

#通訊作者：教授，博士研究生導(dǎo)師。研究方向：緩、控釋靶向制劑。E-mail：cbwu2000@yahoo.com

2011-01-04

2011-02-17）