王 菲，康沛萍，吳曉娟，陳崢宏

貴陽地區(qū)幽門螺桿菌臨床分離株中ureA、cagA、vacA、iceA基因的分布及分析＊

王 菲，康沛萍，吳曉娟，陳崢宏

目的了解貴陽地區(qū)臨床分離的幽門螺桿菌（Hp）的毒力基因ureA、cag A、vac A、iceA的分布特征，探討不同毒力基因型與上消化道疾病的關(guān)系。方法用特異的16S rDNA聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行臨床分離Hp的菌種鑒定，對(duì)經(jīng)過鑒定的152株幽門螺桿菌進(jìn)行ureA、cag A、vac A、iceA基因及亞型的PCR檢測(cè)。結(jié)果ureA基因的檢出率為100%（152／152），vac A基因的檢出率為100%（152／152），vac A 基因亞型以s1a－m2型為主，占76．3%（116／152），cag A 基因檢出率為39．5%（60／152），ieeA1基因檢出率36．8% （56／152），iceA2基因檢出率為34．2%（52／152），13．2%（20／152）的菌株iceA1和iceA2基因均陽性，不同基因型菌株在慢性胃炎和消化性潰瘍中的檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。結(jié)論貴陽地區(qū)幽門螺桿菌毒力基因vac A以s1a－m2型為主，cag A陰性比例高于cag A陽性，不同基因型菌株與消化性疾病間無明顯相關(guān)性。

幽門螺桿菌；毒力基因；上消化道疾病

幽門螺桿菌（Hp）是慢性活動(dòng)性胃炎的病原菌，消化性潰瘍和胃MALT淋巴瘤的重要致病因子，與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。Hp感染人群大多無癥狀，只有少數(shù)人可表現(xiàn)不同程度的癥狀，目前認(rèn)為與宿主易感性、環(huán)境因素及Hp菌株的毒力差異相關(guān)［1］。Hp的毒力基因?yàn)関ac A、cag A 和ice A［2］?？张荻舅鼗颍╲ac A）編碼產(chǎn)生空泡毒素（Vac A），可引起胃粘膜上皮細(xì)胞損傷。vac A結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要由信號(hào)序列（s區(qū)）和中間區(qū)域（m區(qū)）兩個(gè)可變區(qū)組成。信號(hào)序列將HP分為sla、slb、s2三種基因型，中間區(qū)域分為m1、m2基因型。研究表明，不同Hp菌株的vac A基因型致病能力存在差異。cag A基因編碼細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A，cag A致病島是Hp引起胃腸疾病的主要因素。攜帶接觸誘導(dǎo)基因（ice A）的Hp菌株與消化性潰瘍和胃粘膜IL－8水平顯著相關(guān)。尿素酶是尿素酶基因的編碼產(chǎn)物，其中ureA為結(jié)構(gòu)基因，尿素酶能使Hp定植于胃粘膜上皮細(xì)胞，是Hp感染的首要因素。本研究采用PCR方法對(duì)貴陽地區(qū)分離的Hp臨床菌株進(jìn)行了ureA、cag A、vac A和iceA基因型檢測(cè)，以了解貴陽地區(qū)Hp的優(yōu)勢(shì)基因型及與不同疾病的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 材料 哥倫比亞瓊脂、幽門螺桿菌選擇添加劑，購于北京友康基業(yè)生物技術(shù)公司；厭氧罐，微需氧產(chǎn)氣袋購自日本三菱化學(xué)株式會(huì)社，DP302－02柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、Hp16S r RNA引物、cag A引物、vac A及亞型引物、ure A引物 、ice A引物和2×Taq PCR Master Mix，均購自北京天根生物工程有限公司。

1．2 患者標(biāo)本 共選取貴陽市第一人民醫(yī)院經(jīng)內(nèi)鏡或手術(shù)病理證實(shí)慢性胃炎（CG）187例、消化性潰瘍（PU）92例和胃癌（GC）24例患者胃粘膜組織標(biāo)本。

1．3 Hp菌株的分離和培養(yǎng) 用滅菌小剪刀剪碎，接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，用L型玻棒將組織均勻涂布于培養(yǎng)基，置37℃微需氧環(huán)境中培養(yǎng)4 d，挑取可疑菌落增菌，獲得180株Hp疑似菌株。

1．4 Hp臨床分離菌株的鑒定 可疑細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色形態(tài)學(xué)、尿素酶試驗(yàn)鑒定后，采用DP302－02柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，分別提取180株菌株的總DNA，以此作為模板，進(jìn)行Hp菌種特異性16S r DNA的PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)對(duì)其進(jìn)行［3］。

1．5 Hp 菌株的ure A、cag A 、vac A、iceA 基因及亞型檢測(cè) 參考文獻(xiàn)［4］合成 Hp的ure A、cag A、iceA和vac A基因的引物。以經(jīng)形態(tài)學(xué)、尿素酶試驗(yàn)和16S r DNA鑒定為Hp的臨床菌株的總DNA作為模版，分別采用相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS11．5軟件，采用χ2檢驗(yàn)，對(duì)基因分型結(jié)果及與不同疾病的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。

2 結(jié) 果

2．1 Hp菌株的鑒定 303例胃粘膜標(biāo)本共分離出180株革蘭染色陰性螺旋狀或彎曲桿狀，尿素酶試驗(yàn)陽性的菌株，經(jīng)過16S r DNA的PCR檢測(cè)鑒定，其中152株為陽性，確定為Hp。

2．2 Hp臨床分離株的ure A、cag A 、vac A、ice A 基因分布：所有152例患者感染的Hp－DNA標(biāo)本共檢出ure A陽性152份，陽性率100%；vac A陽性152份，陽性率100%，vac Asla基因型為94．1%（143／152），vac Aslb 基因型為5．9%（9／152），vac Am1基因型占15．8%（24／152），vac Am2基因型占81．6%（124／152），另有2．6%（4／152）的菌株不能用vac Aml和vac Am2分型。vac Asla－m2組合的基因型占76．3%（116／152），vac Asla－m1組合的基因型為15．8%（24／152），vac Aslb－m2組合的基因型為5．3%（8／152），另有4株信號(hào)序列為s1a，但中間區(qū)域不能分型。全部菌株中不存在s2基因型。vac As1a－m2型明顯多于其他型別（P＜0．05）。cag A基因陽性60份，陽性率為39．5%。56例（36．8%）為ice A1型，52例（34．2%）為ice A2型，其中20例為iceA1和iceA2混合型，24例為iceA陰性。

2．3 不同基因型與疾病的相關(guān)性 表1中可見，vac A基因中s1a型多于s1b型，m2型明顯多于m1型（P＜0．01）。vac Asla－m2組合在慢性胃炎、消化性潰瘍及胃癌組Hp中陽性率分別為85．2%，77．4%，72．7%；cag A 的 陽 性 率 分 別 為37．5%，39．6%，54．5%；iceA1 型 的 陽 性 率 為 35．2%，37．7%，45．5%；ice A2 型 的 陽 性 率 為 34．1%，33．9%，36．4%；不同vac A 亞型與慢性胃炎、消化性潰瘍及胃癌間未見明顯相關(guān)性（P＞0．05）；而ureA、cag A、iceA基因在不同臨床疾病間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。

表1 152株臨床分離的Hp ureA、cag A、vacA、iceA在各疾病組的分布（株（%））Table 1 Status of ureA，cag A，vacA and iceA gene in patients with CG，PU and GC

3 討 論

在幽門螺桿菌的致病機(jī)制中，vac A和cag A是公認(rèn)的兩種重要毒力基因。研究表明［5］vac A和cag A聯(lián)系緊密，在結(jié)構(gòu)和功能上又相互獨(dú)立的毒力因子，決定著Hp毒力的高低，vac A（＋）和cag A（＋）的Hp存在致病的協(xié)同性，可加重胃粘膜炎癥和胃粘膜上皮細(xì)胞的惡化。所有的Hp菌株均含有vac A基因，但只有50%的Hp表達(dá)有空泡毒性蛋白。不同的vac A基因型別其分泌的空泡毒素在活性和量上有很大的差異。vac Asla－ml型菌株分泌的毒素活性最強(qiáng)，其次是s1a－m2型菌株。sla型菌株與高水平的空泡毒素活性、胃粘膜炎癥和消化性潰瘍密切相關(guān)。slb型菌株具有中等強(qiáng)度的致潰瘍活性，而且slb型Vac A在體外較sla型Vac A具有較弱的細(xì)胞毒活性。cag A基因表達(dá)細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白，普遍認(rèn)為攜帶cag A基因是Hp毒力較強(qiáng)的標(biāo)志。攜帶接觸誘導(dǎo)基因（iceA）被認(rèn)為是Hp菌株的又一毒力基因，攜帶有ice A的Hp菌株與消化性潰瘍顯著相關(guān)。iceA存在兩個(gè)基因變異體iceA 1和ice A2。

Hp基因型流行病學(xué)狀況在世界范圍內(nèi)存在地理差異性，地區(qū)間的差異和相似可能提示Hp的流行趨勢(shì)、傳播方向和來源［6］。我國上海的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)豽ac A基因型均為s1a－m2型，廣東地區(qū)則以s1a－m2型為主。Hp菌株的cag A基因檢出率在西方國家約60%，而日本、中國等亞太國家分離的Hp菌株cag A 基因檢出率可高達(dá)90%。iceA1和ice A2的單獨(dú)檢出率在各地報(bào)道中差異很大，我國同其他東南亞地區(qū)以iceA1型感染為主。

本研究通過對(duì)貴陽地區(qū)分離的Hp菌株進(jìn)行了ureA、cag A 、vac A、iceA 基因檢測(cè)，結(jié)果見：Hp ure A基因檢出率為100%；Hp vac A基因分型有s1a－m2型，s1a－m1型，s1b－m2型，沒有發(fā)現(xiàn)s2型，其中s1a－m 2型為最主要的優(yōu)勢(shì)基因型，占76．3%，這與中國各地的報(bào)道一致，在本研究中有4株Hp菌株vac Am區(qū)基因PCR擴(kuò)增陰性，不能用m1和m2分型，其他文獻(xiàn)亦有報(bào)道［7］，是否出現(xiàn)變異或其他新的分型，需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證；cag A基因的檢測(cè)陽性率為39．5%，遠(yuǎn)低于國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)值，結(jié)果表明cag A陰性菌株亦可引起消化系統(tǒng)病變，但ca－g A的存在是否與胃粘膜病變的嚴(yán)重程度相關(guān)有待進(jìn)一步證實(shí)；ice A1基因單獨(dú)檢出率36．8%，ice A2基因單獨(dú)檢出率為34．2%，兩基因型的分布未見顯著差異。

結(jié)果說明Hp的毒力基因在貴陽地區(qū)的流行分布有自己的特點(diǎn)，以cag A陰性，vac A s1a－m2型為主。未發(fā)現(xiàn)基因型與慢性胃炎、消化性潰瘍及胃癌間存在相關(guān)性。

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［3］吳曉娟，陳崢宏，王菲．PCR擴(kuò)增16Sr DNA在幽門螺桿菌感染診斷中的運(yùn)用［J］．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志．2010，25（5）：76－78．

［4］Van Doorn LJ，F(xiàn)igueiredo C，Sanna R，et al．Clinical relevance of the cag A，vac A and ice A status of Helicobacter pylori［J］．Gastroentrology，1998，115（1）：58－66．

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［7］孫劍剛，張正茂，田擁軍，等．湖北地區(qū)幽門螺桿菌vac A基因分型及疾病相關(guān)性分析［J］．山東醫(yī)藥，2006，46（31）：11－12．

Helicobacter pylori ureA，cag A，vacA and iceA status of Guiyang area and relationship to clinical outcomes

WANG Fei，KANG Pei－ping，WU Xiao－juan，CHEN Zhen－h(huán)ong
（Guiyang Medical College，Guiyang 550004，China）

In order to study the distribution of vac A subtype and cag A，ureA and iceA gene of Helicobacter pylori（Hp）as well as the relationship between the presence of specific genotypes and upper gastrointestinal disease in Guiyang area，the Hp strains were isolated from the gastric mucous membrane tissue，and identified by PCR of 16sr DNA．Gene cag A、ureA、iceA and gene vac A subtypes of 152 Hp strains were typed using PCR with specific primers．Among 152 Hp－positive samples，the prevalence of ureA and vac A were 100%．It was primarily s1a－m2 in Guiyang area．The prevalence of iceA1 was 36．8%，ice A2 was 34．2%，iceA1 and iceA2 were both found in 13．2%．Results indicated that upper gastrointestinal diseases infection with Hp strains of vac A s1a－m2 subtype dominate in Guiyang area．

Helicobacter pylori；vac A；cag A；ureA ；iceA ；upper gastrointestinal disease

R378．99

A

1002－2694（2011）10－0918－03

＊貴州省科技廳基金資助項(xiàng)目（黔科合J字［2009］2086號(hào)）

陳崢宏，Email：czh009219＠gmc．edu．cn

貴陽醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，貴陽 550004

2011－05－17；

2011－07－09