吉芳坤 ,李中杰 ,邱海燕,肖玉春,景懷琦,段廣才,王 鑫

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病是一種新的腸道傳染病,呈世界性分布,是歐洲一些國家腹瀉的主要病原,這些地區(qū)耶爾森菌引起的胃腸炎和嚴重腹瀉比痢疾還多。1981年我國發(fā)現(xiàn)此病后,開展過全國性調(diào)查研究,分別從人群、動物和外環(huán)境分離出病原菌,證明耶爾森菌在我國的分布非常廣泛[1]。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌感染已經(jīng)成為一個危害公眾健康的嚴重問題,尤其與兒童腸道疾病密切相關(guān),主要系通過與感染動物糞便接觸或攝取被污染的食物感染,人類感染耶爾森菌后可表現(xiàn)出一系列不同癥狀,如:腹瀉、腸系膜淋巴結(jié)炎、假闌尾炎、慢性回腸炎,嚴重者可導致敗血癥[2]。

組織侵襲和細胞內(nèi)寄生是致病菌毒力機制的重要特征,尤其對于腸道致病菌來說顯得更加重要[3]。目前已在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和假結(jié)核耶爾森菌中確定了3種侵襲相關(guān)基因:侵襲素基因(invasin,inv),粘附侵襲位點基因(attachment invasion locus,ail)和耶爾森菌粘附素A基因(yadA)。inv和ail基因都是在染色體上編碼的,而yadA基因是由耶爾森菌的毒力質(zhì)粒編碼[4-5]。耶爾森菌的侵襲性主要還是由染色體基因決定的,因為當菌株的毒力質(zhì)粒丟失時仍然具有侵襲性,而將毒力質(zhì)粒轉(zhuǎn)入非致病菌株后,并不能賦予其侵襲粘附的功能[6]。黃瑛等人通過對中國地區(qū)271株致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和12株參考株的ail基因進行序列分析,將ail基因序列分為3種序列型:高致病株(1b/O∶8)來源的A2型;低致病株(2/O∶9)來源的A1型;新發(fā)現(xiàn)序列型 A3型。分離自寧夏地區(qū)的致病株IE419(2/O∶9)單獨形成的A3型有可能是A1型的突變株,其核酸序列已提交到 GenBank,序列號為 GU72220[7]。為確定新發(fā)現(xiàn)A3序列型ail基因在粘附侵襲能力上是否出現(xiàn)改變以及不同序列型ail基因的粘附侵襲功能是否存在差異,我們將3種序列型ail基因轉(zhuǎn)入非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中,通過體外組織粘附侵襲實驗和其他分子生物學技術(shù)進行詳細分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株標本 代表3種不同序列型ail基因的致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌:A2型代表菌株 Ye92010(1b/O∶8);A1型代表菌株 HA8629(2/O∶9);A3型代表菌株 IE419(2/O∶9)。Ye92010是從一名日本臨床腹瀉病人糞便標本中分離出的致病株;HA8629是在中國河南地區(qū)從腹瀉病人標本中分離出來的致病株;IE419則是從中國寧夏地區(qū)鼠中分離出來的致病株。Y40是在中國江蘇地區(qū)豬中分離出來的非致病株,為1A/O∶8生物血清型。

1.1.2 組織細胞 HEp-2細胞,人類喉癌上皮細胞;HT-29細胞,人類結(jié)腸癌上皮細胞。均來自本實驗室。

1.1.3 質(zhì)粒,感受態(tài)細胞 克隆質(zhì)粒pMD18-T和JM109感受態(tài)細胞均購自 TaKaRa公司。質(zhì)粒pMD18-T結(jié)構(gòu)圖見圖1。

1.1.4 引物合成和DNA測序 引物以O∶8血清型致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的ail基因核酸序列為參考設計。重組質(zhì)粒DNA測序由大連(寶生物)公司完成。

圖1 pMD18-T質(zhì)粒圖譜Fig.1 Map of vectorpMD18-T

1.2 方法

1.2.1ail基因的克隆表達 根據(jù)已獲得的O∶8血清型致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的ail基因的編碼序列設計引物:

通過PCR擴增3種不同代表菌株 Ye92010(1b/O∶8)、HA8629(2/O∶9)、IE419(2/O ∶9)的ail基因,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。通過α-互補藍白斑篩選陽性克隆,將經(jīng)鑒定正確連接的重組質(zhì)粒通過高壓電穿孔儀轉(zhuǎn)入非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 Y40。克隆菌株經(jīng) IPTG誘導表達后,制備成電泳樣品進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.2 體外組織細胞粘附侵襲實驗 將培養(yǎng)至單層細胞的HEP-2和 HT-29細胞以0.25%胰酶(Hyclone)消化后通過細胞計數(shù)適度稀釋使其濃度約為1.0×105cfu/mL。稀釋后的細胞懸液在24孔細胞板中再次培養(yǎng)至單層細胞后以PBS清洗,分別加入800μL不含抗生素的MEM和1640培養(yǎng)液,并加入200μL預先備好的菌液(2.0×107cfu/mL)。作用4.5h后,以0.5%脫氧膽石酸鈉充分裂解細胞以釋放粘附在細胞表面和侵入到細胞內(nèi)部的細菌。將裂解液適度稀釋后涂板計數(shù),并對初始菌量也進行計數(shù)。粘附效率以如下表示:涂板計數(shù)剩余的菌落數(shù)/初始菌量×100。涂板計數(shù)剩余的菌落數(shù)包括細胞周圍粘附的細菌和侵入細胞內(nèi)的細菌。同樣地,侵襲效率可以如下公式表示:慶大霉素處理后剩余菌落數(shù)/初始菌量×100[8-9]。將作用4.5h后的細胞以 PBS清洗后,分別加入含慶大霉素(20μg/mL)的 MEM和 1640培養(yǎng)液,再次培養(yǎng)4h之后可由上述公式計算出其侵襲效率。

1.2.3 顯微鏡下形態(tài)學特征分析 被感染細胞以 PBS清洗后固定,Giemsa染液染色后,通過倒置顯微鏡(Olympus)觀察不同菌株對細胞的粘附侵襲狀況,放大倍數(shù)為10×40。

1.2.4 RT-PCR 提取各致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和克隆菌株的總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成DNA。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測克隆菌株中的ail基因是否在受體菌中成功轉(zhuǎn)錄。

2 結(jié) 果

2.1ail基因的克隆表達

2.1.1 原核重組質(zhì)粒的鑒定 對獲得的克隆菌株進行PCR鑒定,顯示各克隆菌株在1000bp左右的位置有一清晰的條帶,與目的基因的大小基本相符,證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,見圖2。送往 TA KARA公司測序后顯示序列連接正確,實驗中所構(gòu)建的克隆菌株見表1。

圖2 PCR擴增目的片段 ail基因1-Marker依次為:Ye92010、HA8629、IE419、Y40、Y40-Y、Y40-H、Y40-I、陽性對照、MarkerFig.2 Amplification of the strains by PCR

表1 實驗中構(gòu)建的重組克隆菌株Table 1 Recombinant colonies constructed in this study

2.1.2 RT-PCR 提取小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和克隆菌株的總 RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成DNA,并以DNA為模板擴增而來的各PCR產(chǎn)物為陽性對照,確定克隆菌株中的ail基因成功轉(zhuǎn)錄。結(jié)果見圖3。

2.2 組織細胞粘附侵襲實驗:ail基因可以使原先無粘附侵襲特性的大腸桿菌表現(xiàn)出粘附侵襲的功能[10-11],因而ail基因序列的多態(tài)性可能會對其粘附侵襲功能產(chǎn)生影響,分別檢測3種類型陽性克隆菌株對HEP-2 and HT-29細胞粘附侵襲特性。結(jié)果見表2。

圖3 RT-PCR擴增目的片段 ail基因1-Marker依次為:Ye92010、HA8629、IE419、Y40、Y40-Y、Y40-H、Y40-I、Ye92010(2)、空白對照、MarkerFig.3 Amplification of the strains by RT-PCR

表2 重組克隆菌株對組織細胞的粘附性和侵襲性Table 2 Adhesion and invasion of recombinant strains to cultured cells

上表數(shù)據(jù)經(jīng)spss17.0統(tǒng)計軟件分析,結(jié)果顯示:3種類型的克隆菌株在獲得致病性菌株中的ail基因后,未表現(xiàn)出粘附侵襲的能力,且其固有的非特異性粘附功能出現(xiàn)了有統(tǒng)計學意義的下降。進一步做侵襲性實驗后,顯示陽性對照 Ye92010、HA8629、IE419,陰性對照 Y40,Y40轉(zhuǎn)化克隆菌株3組之中克隆菌株與陰性對照之間無差異,兩組數(shù)據(jù)與陽性對照間均存在明顯差異。這說明將ail基因轉(zhuǎn)入已證實無粘附侵襲性的非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌后,對其侵襲特性無明顯影響,但卻降低了其粘附效能。且觀察3個陽性對照的數(shù)據(jù),可發(fā)現(xiàn)HA8629的菌落侵襲水平明顯高于 Ye92010和IE419,可能 HA8629是抗慶大霉素的耐藥株。

2.3 顯微鏡下形態(tài)學特征分析 鏡下觀察不同菌株對細胞的粘附侵襲作用,見圖4。

由下圖可觀察到:Ye92010細菌延細胞邊緣走向清晰可見,排列成鏈狀或桿狀,HA8629、IE419鏡下排列形態(tài)與 Ye92010基本一致,但是菌量較少。非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陰性對照株 Y40背景清晰,菌少見。3種重組克隆菌株與非致病性陰性對照菌株 Y40保持一致,形態(tài)學上無差異。

3 討 論

ail基因的核酸序列包含一個536bp的開放讀碼框架(ORF),編碼一條由178個氨基酸組成的多肽,分子量為19 548Da[12]。此蛋白可以賦予小腸結(jié)腸炎耶爾森菌侵入上皮細胞的能力。體外組織侵襲實驗顯示,依據(jù)細胞種屬的不同,Ail蛋白侵入細胞的能力有一定程度的差異,但是都可以較高水平的顯示粘附的特性[8]。此外,還具有血清抵抗能力[10]。目前研究已經(jīng)證實粘附侵襲位點基因(ail),只存在于流行病學上與疾病相關(guān)的致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中,而inv基因在耶爾森菌屬其他種中也存在,這種結(jié)果顯示ail基因可能在致病機制中起到更重要的作用,假結(jié)核耶爾森菌inv突變株感染小鼠模型證實了這種猜想[11]。來自高致病株8081c(1b/O∶8)的ail基因的轉(zhuǎn)入可以賦予大腸桿菌粘附侵襲上皮細胞的功能,并且克隆菌株抵抗血清殺傷的能力可以達到大腸桿菌本菌的100倍以上[13]。

圖4 不同菌株對 HEp-2細胞的粘附侵襲實驗結(jié)果Fig.4 The invasion and adherence assays of the different strains to HEp-2 cellA:Ye92010,B:HA8629,C:IE419,D:Y40,E:Y40-Y,F:Y40-H,G:Y40-I

大部分流行病學上與疾病無關(guān)的非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌均缺乏對組織細胞的粘附侵襲作用[5,14]。曾有學者對轉(zhuǎn)入ail基因后的非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的侵襲性進行過研究,將有功能的ail基因整合到致病性ail突變菌株或E.coli菌株時均可以賦予受體菌侵襲的表型,而轉(zhuǎn)入非致病性菌株中時并無相應的功能表型,其認為大腸桿菌與非致病性小腸結(jié)腸耶爾森的細胞背景不同,推測在非致病性菌株中可能缺乏一種和Ail蛋白協(xié)同作用的因子[10],同時,因為ail基因只存在于致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中,在非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中缺乏ail基因的同源序列[8],轉(zhuǎn)化后致病性ail突變菌株侵襲功能的重現(xiàn)和非致病性菌株中侵襲功能的持續(xù)缺失意味著在非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌表面結(jié)構(gòu)上可能存在著某種影響重組Ail蛋白與組織細胞作用的因素,最終導致了克隆菌株中侵襲功能的不表達。而對于本次試驗中克隆菌株非特異粘附效能的降低,有可能是ail基因的轉(zhuǎn)入改變了非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌膜表面某些介導非特異性粘附功能的因子的表達或者重組Ail蛋白對非致病耶爾森菌表面介導非特異性粘附功能的因子產(chǎn)生了影響,而出現(xiàn)了整體非特異粘附效能的下降,在侵襲功能上兩者則保持了一致性。因為耶爾森菌對機體細胞的侵襲是一個分為粘附和侵襲的兩步過程,侵入細胞內(nèi)的細菌是先通過粘附作用與細胞相互影響進而進入細胞內(nèi)并與細胞外細菌共同作用致機體患病的[12]。以ail基因突變菌株感染小鼠后,檢測病原菌向 Peyer結(jié)和其他組織器官遷移以及引起致死性感染的能力,結(jié)果顯示,突變株沒有產(chǎn)生可檢測到的Ail蛋白,與野生株相比對CHO細胞的侵襲作用降低[15];Ail蛋白在感染疾病的早期,也就是粘附侵襲階段起著重要的作用[8,10,15]。感染初期,介導的黏附表型的ail基因的缺失,有可能是非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌致病毒力缺失的一個重要因素。

綜上所述,3種不同序列型ail基因轉(zhuǎn)入非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌后,并未賦予其粘附侵襲的功能,有待于進一步研究分析3種序列型ail基因在粘附侵襲功能上的差異。但在本次研究中關(guān)于非致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌ail基因轉(zhuǎn)化克隆菌株的粘附性能反常性降低的發(fā)現(xiàn),將有助于我們更加明確致病性耶爾森菌與宿主細胞之間的相互作用,闡明其粘附侵襲機制及致病機理。

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