江 楠,席曉蘭,王 杰,戴佳琳,廖興江,黃 江

2.貴陽醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室,貴陽 550004;

3.貴陽醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室,貴陽 550004

豬帶絳蟲是常見的人獸共患寄生蟲,在我國病區(qū)多呈片狀分布,其成蟲寄生于人體小腸引起絳蟲病,幼蟲(囊尾蚴)寄生于人體皮下肌肉、腦、眼等處引起囊蟲病[1-2]。近年來,本課題組先后構(gòu)建了3種常見的人體帶絳蟲成蟲cDNA質(zhì)粒文庫,并獲得豬帶絳蟲1 171條UniGene,這些基因涉及到蟲體的結(jié)構(gòu)、代謝、運(yùn)動、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等多方面,我們期望通過進(jìn)一步研究,篩選出具有應(yīng)用價值的免疫診斷抗原或疫苗候選分子[3-4]。蘋果酸脫氫酶(MDH)是三羧酸循環(huán)酶系中的重要組成部分,同時也與天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶一起組成天冬氨酸-蘋果酸穿梭體,參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)間的轉(zhuǎn)移,起到在胞漿和線粒體之間轉(zhuǎn)運(yùn)蘋果酸和還原性平衡物的作用,另外在糖異生和糖酵解等方面也起著重要的作用[5-7]。因此,MDH適宜于篩選特異的抗寄生蟲藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清、文庫、質(zhì)粒和菌株 豬帶絳蟲蟲體標(biāo)本采自四川甘孜雅江,亞洲牛帶絳蟲病人、豬帶絳蟲病人及牛帶絳蟲病人血清取自糞檢陽性的帶絳蟲病人。豬帶絳蟲成蟲全長 cDNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建、EST測序及Unigene分析由北京華大基因有限公司合作完成。大腸埃希菌BL21/DE3及原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)由中山大學(xué)熱帶病重點(diǎn)實驗室惠贈。

1.1.2 主要試劑和工具酶 NdeⅠ、HindⅢ、Ex TaqTM酶 、dNTP、RNaseA 、T4 DNA 連接酶、分子量標(biāo)準(zhǔn):DNA marker DL2000、DL15000均購自大連寶生物工程有限公司,DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA快速提取試劑盒購自賽百盛技術(shù)有限公司(中國北京),異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自Promega公司(美國),Ni-NTA Agarose(Cat.No.30210)購自德國NOVEGN公司,丙烯酰胺、N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)購自上海伸友生物科技有限公司,低分子量蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Fermentas公司(立陶宛),預(yù)染蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)購自 TaKaRa公司(日本),硝酸纖維素濾膜(PVDF)膜購自Millipore公司(美國),大鼠抗HIS標(biāo)簽抗體購自鼎國生物技術(shù)有限公司(中國北京),辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗大鼠、抗人IgG(H+L)抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自Boster公司(中國武漢)。

1.1.3 引物的合成和DNA的測序 基因擴(kuò)增引物由Introvigen上海生物技術(shù)有限公司合成,重組質(zhì)粒DNA的測序由英俊科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 豬帶絳蟲蘋果酸脫氫酶(Ts MDH)基因的識別 本實驗組已經(jīng)成功構(gòu)建了豬帶絳蟲成蟲cDNA質(zhì)粒文庫[8]。將獲得的豬帶絳蟲unigene進(jìn)行Blastx分析,獲得編碼豬帶絳蟲MDH基因的質(zhì)粒,GenBank登陸號為GT227115,并通過瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)(ExPASY,http://ca.expasy.org/)預(yù)測其理化性質(zhì)。

1.2.2 Ts MDH基因的PCR擴(kuò)增 根據(jù)已獲得的MDH編碼序列,利用 DNAClub和PCRdesign設(shè) 計 引 物 。 P1:5′-GGACATATGATGCCTGGACCTCTTAGGGTT-3′,帶 NdeⅠ酶切位點(diǎn) ,P2:5′-GCGAAGCT TTCACT TGAAGGAGGAAAGA GC-3′,帶 HindⅢ酶切位點(diǎn)。

以豬帶絳蟲成蟲cDNA文庫MDH的質(zhì)粒為模版,進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:94℃5 min;94℃30 s;94℃1min,61℃1min,72 ℃1min,共35個循環(huán);72℃10 min。PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳回收

1.2.3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a(+)用 NdeⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切后回收,連接、轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21/DE3感受態(tài)細(xì)胞,卡那霉素篩選陽性單克隆,對該陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR,雙酶切和測序鑒定。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 取50μ L培養(yǎng)過夜的陽性克隆菌液,加入到含有卡那霉素的5mL LB培養(yǎng)基中,37℃250 r/min振搖至吸光度(A600值)=0.4-0.6時,加入IPTG至終濃度為1mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)5h(并做相應(yīng)陰性對照)。離心收集菌體,在沉淀中加入100μ L 1×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液,煮沸5-10min,13 000r/min 離心 1min,取上清 10μ L,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 重組質(zhì)粒的大量誘導(dǎo)和純化 按上述方法對陽性克隆進(jìn)行大量的誘導(dǎo)表達(dá),離心收集菌體,冰上超聲裂解,分別取上清和沉淀樣品處理后行SDSPAGE判斷該重組蛋白的可溶性。并收集上清,用0.45μ L濾膜過濾,參照鎳離子金屬螯合劑親和層析柱說明書進(jìn)行蛋白純化,收集蛋白洗脫液,再將洗脫的目的蛋白在PBS透析液(pH=7.4)中4℃透析24h(期間換透析液 2-3次),并根據(jù)說明書,用Bradford[9]法對經(jīng)過以上步驟獲得的重組蛋白進(jìn)行蛋白定量,于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 重組蛋白的蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分析 將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE(12%)電泳,將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,BSA室溫封閉2h,再分別與亞帶、牛帶、豬帶絳蟲病人、感染豬帶絳蟲的豬血清、正常人血清、SD大鼠免疫血清及SD大鼠正常血清(按1∶200稀釋)孵育,4℃過夜;次日,PBS洗3次,每次5min,然后與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗豬、羊抗鼠、兔抗人IgG(按1∶2 000稀釋)室溫孵育 1h,PBS洗3次,每次5min;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色至出現(xiàn)目的條帶,超純水終止反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1 MDH基因的識別和生物信息學(xué)分析 在已獲得的cDNA文庫Unigene中,經(jīng)Blastx分析該基因全長1 343bp,編碼區(qū)為 1 78bp～1 173bp,編碼332個氨基酸,理論分子量是36459.2kDa,等電點(diǎn)是8.39。

2.2 原核重組載體的鑒定 將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定,產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,見圖1。結(jié)果顯示在1000bp左右有一清晰條帶,與目的基因預(yù)測大小基本相符,此外重組質(zhì)粒的測序報告表明插入序列與理論序列一致,證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant by digestion with NdeⅠand HindⅢ

2.2 蛋白純化結(jié)果 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21/DE3中表達(dá),SDS-PAGE電泳分析結(jié)果如圖2中顯示,大約在41kDa左右處出現(xiàn)目的條帶,與理論分子量基本相符。將蛋白進(jìn)行純化,結(jié)果如圖中第7泳道所示,其位置與目的蛋白相符,證明目的蛋白純化成功。測得純化產(chǎn)物的蛋白濃度為0.32mg/mL。

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-MDH在大腸桿菌BL21/DE3的原核表達(dá)及其純化產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified product of pET-28a(+)-MDH

2.3 重組蛋白免疫原性鑒定 用純化蛋白免疫SD大鼠8周后的血清及正常大鼠血清與純化蛋白進(jìn)行Western Blotting,結(jié)果見圖3,結(jié)果顯示重組蛋白可被其免疫的SD大鼠血清識別,而不能被正常大鼠血清所識別。

圖3 Ts MDH重組蛋白免疫原性的Western blotting分析Fig.3 Western blot analysis of Ts MDH

2.4 重組蛋白免疫反應(yīng)性鑒定 用感染豬帶絳蟲、亞洲帶絳蟲、牛帶絳蟲的患者血清及豬帶絳蟲感染豬的血清與純化蛋白進(jìn)行 Western Blotting,結(jié)果均顯示出較清晰條帶,見圖4中第1、2、3、4泳道,而陰性對照血清即健康人血清,未出現(xiàn)蛋白條帶,見圖4中第5泳道。

圖4 Ts MDH重組蛋白免疫反應(yīng)性的Western blotting分析Fig.4 Western blot analysis of Ts MDH

3 討 論

豬帶絳蟲在全世界分布很廣,在我國分布也很普遍。分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,利用基因工程疫苗進(jìn)行絳蟲病的診斷及預(yù)防已是備受關(guān)注的研究方向,而多種組合疫苗的聯(lián)合免疫,也是今后研制絳蟲疫苗的一個主要方向。要達(dá)到這個目的,篩選并克隆較多有用的基因就成為現(xiàn)階段本課題組的研究重點(diǎn)。蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase,MDH)普遍存在于動物、植物和細(xì)菌中等各種生物中,根據(jù)其輔酶的特異性和在細(xì)胞內(nèi)的分布和生理功能的不同,MDH在不同生物中可分為不同的類型,即依賴于氧化型輔酶Ⅰ(NAD)的MDH和依賴于氧化型輔酶Ⅱ(NADP)的 MDH;位于胞漿的MDH和位于線粒體的MDH[10]。作為三羧酸循環(huán)酶系中的重要組成部分,催化了草酰乙酸和蘋果酸之間的相互轉(zhuǎn)換,同時也與天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶一起組成天冬氨酸-蘋果酸穿梭體,參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)間的轉(zhuǎn)移,起到在胞漿和線粒體之間轉(zhuǎn)運(yùn)蘋果酸和還原性平衡物的作用;在糖異生和糖酵解等方面也起著重要的作用,是細(xì)胞中不可缺少的酶。

本次實驗,我們通過生物信息學(xué)的相關(guān)軟件進(jìn)行分析,預(yù)測重組蛋白理論分子量是41kDa,圖2的4、5、6、7泳道顯示的重組蛋白與預(yù)期的大小一致,且條帶較濃,表明重組蛋白獲得高效表達(dá),同時純化的重組蛋白濃度達(dá)到0.32mg/mL,足以進(jìn)行各種酶學(xué)實驗,可為該蛋白下一步研究奠定基礎(chǔ)。由于抗生物學(xué)物質(zhì)的抗體容易制取,并具有高度特異性,因此抗體成為許多分析和制備生化方法的核心。Western-blotting就是以抗體-抗原沉淀反應(yīng)為基礎(chǔ)的方法,可用于不同抗原的比較和定量,能檢測樣品中的微量成分和近似相對分子質(zhì)量。既可以定性,又可以半定量[11-13]。圖3結(jié)果顯示重組蛋白可被重組蛋白免疫大鼠血清所識別,說明重組蛋白能夠刺激大鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)抗體,具有免疫原性;圖4中重組蛋白能被豬帶絳蟲病人血清所識別,表明重組蛋白能夠與患者血清中的特異抗體反應(yīng),說明該重組蛋白具有免疫反應(yīng)性;但因其還可與其他兩種帶絳蟲感染血清發(fā)生反應(yīng),證明其診+斷特異性不高,推測不能作為診斷候選分子,但其具有免疫活性的高效表達(dá),也可推測Ts MDH是一個具有開發(fā)潛力的基因,而本實驗也為此基因重組蛋白的進(jìn)一步研究,特別是免疫學(xué)方面的功能等各方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

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