黃云先

(云南省麗江市藥品檢驗所，云南 麗江 674100)

小兒導(dǎo)赤片質(zhì)量控制方法改進研究

黃云先

(云南省麗江市藥品檢驗所，云南 麗江 674100)

目的建立小兒導(dǎo)赤片中大黃、梔子含量測定的高效液相色譜(HPLC)法及梔子的薄層色譜(TLC)鑒別方法。方法用TLC法和HPLC法對小兒導(dǎo)赤片中大黃及梔子進行定性、定量分析。結(jié)果TLC色譜中，梔子苷和梔子對照藥材斑點清晰。大黃素質(zhì)量濃度的線性范圍為8.096～104.48 μg/mL(r=0.999 9)，平均回收率為 98.01%(RSD為 1.25%);大黃酚質(zhì)量濃度的線性范圍為 10.83 ～112.23 μg/mL，r=0.999 9;蘆薈大黃素的線性范圍為 8.12 ～89.90 μg/mL，r=0.999 8;大黃酸的線性范圍為 9.96 ～89.48 μg/mL，r=0.999 8;大黃素甲醚的線性范圍為 8.896 ～ 54.44 μg/mL，r=0.999 7;梔子苷的線性范圍為 6.771 ～ 141.48 μg/mL(r=1.000 0)，平均回收率為 99.04%(RSD為 1.20)。結(jié)論定性鑒別方法專屬、斑點清晰;含量測定方法可靠，重現(xiàn)性好。

大黃素;大黃酚;蘆薈大黃素;大黃酸;大黃素甲醚;高效液相色譜法;梔子;梔子苷;薄層色譜法

小兒導(dǎo)赤片由大黃、梔子、地黃、甘草、茯苓、木通、滑石7味藥組方，具有清熱利便功效，適用于胃腸積熱、口舌生瘡、咽喉腫痛、牙根出血、腮頰腫痛、暴發(fā)火眼、大便不利、小便赤黃，為治療小兒實熱積滯的常用藥。其藥品標(biāo)準(zhǔn)中僅有大黃藥材的鑒別[1]，沒有其他藥材鑒別和含量測定要求，不能有效地控制藥品質(zhì)量。本試驗增加了梔子的薄層色譜(TLC)鑒別，并用高效液相色譜(HPLC)法測定大黃的大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚含量及梔子的梔子苷含量，結(jié)果令人滿意。

1 儀器與試藥

Dionex summit高效液相色譜儀;Dionex U－3000型紫外檢測器;Benchtop Cleaners HS6150D型超聲儀;BT 224S型電子天平，BP211D型電子分析天平(德國賽多利斯)。梔子苷對照品(批號為110749－200512)、大黃酚對照品(批號為0796－200208)、大黃素對照品(批號為110756－200110)、蘆薈大黃素對照品(批號為110795－200605)、大黃酸對照品(批號為 110757－200206)、大黃素甲醚對照品(批號為110758－200610)，均購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇為色譜純，購自Fisher Scientific公司，水為UP水，其余試劑均為分析純;薄層板為預(yù)制板。小兒導(dǎo)赤片(云南白藥集團麗江藥業(yè)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子的TLC鑒別[2]173

取本品10片，研細，加甲醇20 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液;另取梔子對照藥材1 g，加甲醇同法制成對照藥材溶液;再取梔子苷對照品，加甲醇制成4 g/L的對照品溶液。照TLC法試驗[2]附錄31，吸取供試品溶液和對照品液溶各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯－丙酮－甲酸 －水(5∶5∶1∶1)為展開劑展開，取出，晾干。供試品溶液色譜中，在與對照藥材及對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同黃色斑點;再噴以10%硫酸乙醇溶液，在與對照藥材溶液及對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(圖1)。

2.2 大黃的含量測定

2.2.1 溶液制備

圖1 梔子薄層色譜圖

分別精密稱取干燥至恒重的大黃素對照品8.32 mg、大黃酚對照品 8.54 mg、蘆薈大黃素對照品9.72 mg、大黃酸對照品 8.64 mg 及大黃素甲醚對照品4.29 mg，分別置100 mL量瓶中，用適量甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為 83.2，85.4，97.2，86.4及 42.9 μg/mL的對照品貯備液[3]17;再分別精密量取上述對照品貯備液各2 mL，混勻，即得對照品混合溶液。取本品20片，研細，取細粉約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，密塞，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置燒瓶中，揮去甲醇，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理5 min，再加氯仿10 mL，加熱回流1 h，冷卻，移至分液漏斗中，用少量氯仿洗滌容器，洗液并入分液漏斗中，分取氯仿液，酸液用氯仿振搖提取3次，每次10 mL，合并氯仿液，減壓回收溶劑至干，殘渣用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過后取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Shim－pack CLC－ODS色譜柱(250 mm×6.0 mm，5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:甲醇 －0.1% 磷酸溶液(85 ∶15)[2]17;流速:1 mL/min;進樣量:20 μL;檢測波長:254 nm。在此條件下，大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚理論板數(shù)分別為3 953，4 148，4 984，5 314，4 945，分離度均大于 1.5，色譜圖見圖 2。

圖2 大黃含量測定高效液相色譜圖

2.2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗[2]附錄31:按處方量制備缺大黃藥材的陰性樣品，照供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液，依法進樣。結(jié)果陰性對照品溶液色譜圖中，在大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚色譜峰相應(yīng)的保留時間無干擾峰出現(xiàn)(圖2 C)。

線性關(guān)系考察:分別精密吸取大黃素、大黃酚等5種對照品貯備液 2，4，6，8，10 mL，分別置 25 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積。以質(zhì)量濃度(X)對峰面積(Y)進行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 大黃含量測定線性關(guān)系考察結(jié)果(n=5)

精密度試驗:取2.2.1項下對照品混合溶液，重復(fù)進樣5次，記錄色譜圖，測定峰面積。結(jié)果大黃素的RSD為0.12%，大黃酚的RSD為0.20%，大黃酸的RSD為0.40%，蘆薈大黃素的RSD為0.37%，大黃素甲醚的RSD為0.56%。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液(批號為011307002)，室溫下放置，分別于 0，2，4，6，8 h 時進樣，分別測定峰面積。結(jié)果大黃素的RSD為0.15%，大黃酚的RSD為0.32%，大黃素甲醚的RSD為0.55%，大黃酸的RSD為0.60%，蘆薈大黃素的RSD為0.23%。

重復(fù)性試驗:取同一批(批號為011307002)樣品5份，依法測定含量。結(jié)果平均含量大黃素為1.104 mg/g(RSD=0.64%)，大黃酚 為 1.420 mg/g(RSD=0.22%)，大 黃 素 甲 醚 為 0.624 mg/g(RSD=0.78%)，大黃酸為 1.717 mg/g(RSD=0.47%)，蘆薈大黃素為0.019 mg/g(RSD=1.11%)，表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品(批號為01307002)約0.3 g，精密稱定，共5份，精密加入大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酸、蘆薈大黃素對照品，測定含量，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酸、蘆薈大黃素加樣回收試驗結(jié)果(n=5)

2.2.4 樣品含量測定

分別吸取對照品混合溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，用外標(biāo)法計算含量。結(jié)果樣品中大黃各組分總含量見表3。

2.3 梔子的含量測定

2.3.1 溶液制備

分別精密稱取干燥至恒重的梔子苷對照品6.13 mg，置100 mL量瓶中，用適量甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.061 3 g/L的對照品貯備液，精密量取5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻即得對照品溶液。取本品20片，研細，取細粉約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷，密塞，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

表3 樣品含量測定結(jié)果(n=4)

2.3.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗[3]173

色譜柱:Shim－pack CLC－ODS色譜柱(150 mm×6.0 mm，5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:乙腈 － 水(15 ∶85);流速:1 mL/min;進樣量:20 μL;檢測波長:238 nm。在此條件下，梔子苷理論板數(shù)為8 117，分離度大于 1.5，色譜圖見圖 3。

圖3 梔子含量測定高效液相色譜圖

2.3.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗:按處方制備缺梔子藥材的陰性對照品溶液，進樣測定。結(jié)果陰性對照品溶液色譜中，在梔子苷色譜峰相應(yīng)的保留時間無干擾峰出現(xiàn)(圖3 C)。

線性關(guān)系考察:分別精密吸取梔子苷對照品溶液2，4，6，8，10 mL，分別置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積。以質(zhì)量濃度(X)對峰面積(Y)進行線性回歸，回歸方程為Y=90 057X－3 625，r=0.999 9(n=5)。結(jié)果表明梔子苷質(zhì)量濃度在 0.490 4 ～24.52 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗:取同一梔子苷對照品溶液，重復(fù)進樣5次，記錄色譜圖。結(jié)果峰面積的RSD為0.88%(n=5)。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液(批號為011307002)，室溫下放置，分別于 0，2，4，6，8 h時進樣，測定峰面積。結(jié)果的RSD為0.86%(n=5)。

重復(fù)性試驗:取同一批(批號為011307002)的樣品5份，依法測定含量。結(jié)果平均含量為 1.491 1 mg/g，RSD為 1.54%(n=5)，表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品(批號為011307002)約0.3 g，精密稱定，共5份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入梔子苷對照品，按供試品溶液制備方法操作及樣品測定項下方法測定含量，計算回收率。結(jié)果見表4。

表4 梔子苷加樣回收試驗結(jié)果(n=5)

2.3.4 樣品含量測定

分別吸取2.3.1項下的對照品混合溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，用外標(biāo)法計算含量。結(jié)果見表5。

3 討論

用TLC法鑒別小兒導(dǎo)赤片中梔子，斑點清晰，專屬性強，且操作簡便。

通常大黃蒽醌類成分的檢測波長為254 nm，選用該波長時，其他組分及輔料無干擾。

樣品用甲醇超聲處理后直接進樣所得色譜基線波動較大，分離度差，且提取不完全，測得的含量低[3－5]。本試驗先后用甲醇、氯仿作溶劑，并采用超聲、加熱回流、酸水解后提取的方法，大黃中的蒽醌類成分已基本提取完全，測得的含量高。

表5 樣品含量測定結(jié)果(n=4)

方法學(xué)考察結(jié)果表明，用HPLC法測定該復(fù)方制劑的大黃中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酸、蘆薈大黃素總含量，方法及梔子的梔子苷含量，方法簡便可靠，分離度好，結(jié)果穩(wěn)定。

[1]WS3－B－3537－98，衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第十九冊)·小兒導(dǎo)赤片[S].

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[3]肖培根.新編中藥志(第一卷)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2002.

[4]方 彬，呂風(fēng)蓮，劉傳玲，等.高效液相色譜法測定虎杖中大黃素的含量[J].中國藥師，2005，19(2):106 －107.

[5]張玉臣，劉學(xué)東，王永平，等.HPLC測定大黃顆粒中大黃素和大黃酚的含量[J].中國藥師，2005，19(3):158 －159.

Study on Determination of Rhubarb and Gardenia in Child Daochi Tablets by HPLC and Identification of Gardenia by TLC

Huang Yunxian
(Lijiang Institute for Drug Control，Lijiang，Yunnan，China674100)

ObjectiveTo establish a HPLC determination method for rhubarb and gardenia in the Child Daochi Tablets and a TLC identification method for gardenia.Methods The TLC and HPLC methods were adopted to perform the qualitative and quantitative analysis on rhubarb and gardenia in Child Daochi Tablets.Results The spots of the comparison medicinal material for gardenoside and gardenia were fairly clear by TLC identification.In HPLC quantitative analysis，the linear range of emodin was 8.096 －104.48 μg/mL(r=0.999 9)，the average recovery rate was 98.01%(RSD=1.25%);the linear range of chrysophanol was 10.83 － 112.23 μg/mL(r=0.999 9);the linear range of aloe － emodin was 8.12 －89.90 μg/mL(r=0.999 8);the linear range of rhein was 9.96 －89.48 μg/mL(r=0.999 8);the linear range of physcion was 8.896 － 54.44 μg/mL(r=0.999 7);the linear range of geniposide was 6.771 － 141.48 μg/mL(r=1.000 0)，the average recovery rate was 99.04% (RSD=1.20).Conclusion The qualitative identification method is exclusive with clear spots;the content determination method is reliable with good reproducibility，which provides the basis for the quality control and evaluation of Child Daochi Tablets.

emodin;chrysophanol;aloe－emodin;rhein;physcion;HPLC;gardenia;geniposide;TLC

R284.1;R286.0

A

1006－4931(2011)02－0036－03

2009－06－29;

2010－05－24)