謝俊，許淼，龔秀麗，曲立娟，顏景斌，黃英

自 1982 年世界上首次通過轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)獲得“巨鼠”[1]以來，轉(zhuǎn)基因動物的研究發(fā)展迅速。隨著多種轉(zhuǎn)基因動物的成功獲得，研究者設想利用動物表達外源基因，以動物個體作為一個反應器來生產(chǎn)有價值的蛋白質(zhì)。由于動物乳腺作為外分泌器官，乳汁不進入體內(nèi)循環(huán)，不影響轉(zhuǎn)基因動物本身生理代謝反應；并且外源蛋白產(chǎn)量高，易提純，經(jīng)充分修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性，因此乳腺生物反應器顯示了很好的應用前景。目前，百余種多肽類藥物、疫苗、抗體、酶制劑等已在不同種動物乳腺生物反應器中表達，其中近 30 種重組蛋白產(chǎn)品藥物已進入臨床試驗不同階段，如用于治療抗凝血酶缺乏癥的抗凝血酶 III 已上市[2]。然而，在乳腺生物反應器研發(fā)過程中，外源基因表達不高和整合位點的多樣化一直制約著乳腺生物反應器的研發(fā)進度。在前期的研究中，本研究所構(gòu)建了乳腺特異啟動子調(diào)控的人轉(zhuǎn)鐵蛋白（human transferrin，hTF）表達質(zhì)粒，通過原核法獲得了表達水平較高的轉(zhuǎn)基因小鼠，但這些轉(zhuǎn)基因小鼠中轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達卻出現(xiàn)了明顯的差異（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。由此猜想，外源基因的不同表達水平與外源基因的整合位點情況有關(guān)，即與整合時插入位點直接相關(guān)，造成位置效應影響[3]。因此，本文試圖通過分析不同表達水平轉(zhuǎn)基因小鼠外源基因的整合位點旁側(cè)序列情況，探討轉(zhuǎn)基因整合位點與其表達效應之間的關(guān)系，為尋找高表達位點以構(gòu)建定點整合載體來制備轉(zhuǎn)基因動物提供有指導價值的理論和技術(shù)基礎。

通常進行轉(zhuǎn)基因整合位點的研究是采用染色體步移技術(shù)，而在眾多染色體步移方法中，反向 PCR（inverse PCP，IPCR）是應用最早，也是最常用的方法之一[4]。由于靶序列在質(zhì)粒、細菌基因組中豐度較高，易擴增，因而用反向 PCR技術(shù)獲得質(zhì)粒及細菌基因組的旁側(cè)序列較為簡單，但是，當用反向 PCR 擴增哺乳動物細胞基因組導入的外源基因序列旁側(cè)片段時，由于待擴增的靶序列在基因組中往往含量極微量，再加上連接效率有限，很難一步直接得到所需片段[5]。本文通過優(yōu)化和改進反向 PCR 的技術(shù)中各個環(huán)節(jié)，成功獲得了不同表達水平的 hTF 轉(zhuǎn)基因小鼠旁側(cè)序列，這為整合位點的序列結(jié)構(gòu)和調(diào)控元件分析研究及制備乳腺特異、高表達轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)平臺奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 限制性內(nèi)切酶和 T4 連接酶、LATaq 酶、載體 pMDl9T、dNTPmix 等均為日本 Takara 公司產(chǎn)品；凝膠回收試劑盒、感受態(tài)細胞 TOP10 為本所保存；GeneRulerTM1 kb DNA ladder 為美國 MBI 公司產(chǎn)品。

1.1.2 實驗動物 本所轉(zhuǎn)基因小鼠制備平臺自制，清潔級KM 品系，飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)內(nèi)，恒溫恒濕，12 h 光照，實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2008-0051。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠的獲得及選取 實驗小鼠是采用本所構(gòu)建的山羊-β 酪蛋白乳腺特異啟動子（簡稱 P1A3）攜帶人轉(zhuǎn)鐵蛋白基因載體（P1A3-hTF-neo），通過顯微注射獲得轉(zhuǎn)基因小鼠[6]。從轉(zhuǎn)基因小鼠中選取轉(zhuǎn)鐵蛋白表達水平較高（7.1 mg/ml）的個體（TFN-6）和表達水平很低（2.3 μg/ml）的個體（TFN-8）進行分析。

1.2.2 小鼠基因組總 DNA 抽提 小鼠生長至 2 周齡后，剪 1 ～ 2 cm 鼠尾巴，鼠尾組織用消化液[50 mmol/L Tris·HCl，100 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），100 mmol/L NaCl，l% SDS]及終濃度為 1% 的蛋白酶 K，56 ℃ 消化16 h，用酚/氯仿法常規(guī)抽提組織 DNA。

1.2.3 基因組 DNA 酶切和產(chǎn)物連接 取 200 ng 基因組DNA，用 BamH I 和 Bgl II 限制性內(nèi)切酶進行酶解，反應體系如下：基因組 DNA 2 μl（100 ng/μl），10 × Buffer 5 μl，100 × BSA（牛血清白蛋白）0.5 μl，BamH I 和 Bgl II 各1 μl（10 ～ 15 U/μl），加水補至 50 μl，在 37 ℃ 水浴鍋中反應 2 ～ 4 h，取 6 μl 酶切產(chǎn)物通過 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。剩余產(chǎn)物用酚/氯仿抽提，加 2 倍體積的無水乙醇，加入總體積 10% 的 3 mol/L 醋酸鈉（NaAc）于 –80 ℃ 過夜，離心風干產(chǎn)物后溶于 10 μl 無菌水中。取 5 μl 溶解產(chǎn)物，加入 10 × Ligase Buffer 15 μl，T4 連接酶 1 μl（350 U）加水補至 150 μl，16 ℃ 反應過夜。次日再用酚/氯仿抽提連接產(chǎn)物，再加 2 倍體積的無水乙醇沉淀，并加入總體積10% 的 3 mol/L NaAc 沉淀 DNA，并且延長低溫沉淀的時間（–80 ℃ 過夜）以提高回收產(chǎn)物的效率。抽提純化后的DNA，通過紫外分光光度計選用 OD260/OD280 比值 1.8 ～2.0 及瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 純度進行后續(xù)實驗。離心風干后的產(chǎn)物溶于 10 μl 無菌水中，取其中 1 μl 的溶解液作為首輪 PCR 的模板。

1.2.4 反向 PCR 根據(jù)顯微注射制備轉(zhuǎn)基因小鼠所用的質(zhì)粒 DNA（pcDNA3.1-P1A3-Transferin）的 P1A3 啟動子5’ 端區(qū)設計兩對反向 PCR 引物（表 1）。引物 T5-2 和T5-3 用于第一輪 PCR，反應 PCR 體系包括：1 μl 自連接模板 DNA，5 μl 10 × 連接 Buffer，8 μl 2 mmol/L dNTPs，10 μmol/L 引物 T5-2 和 T5-3 各 1 μl，0.5 μl LA Taq 聚合酶，加去離子水至 50 μl。反應條件為：94 ℃ 5 min，之后94 ℃ 1 min，60 ℃ 45 s，72 ℃ 5 min，30 個循環(huán)。反應結(jié)束后，取第一輪反應產(chǎn)物 1 μl 作為模板，10 μmol/L 引物T5-1 和 T5-4 各 1 μl，進行第 2 次 PCR，反應參數(shù)同第一輪。反應結(jié)束后，取 5 μl PCR 產(chǎn)物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳拍照，并用 Xhol I 限制性內(nèi)切酶對擴出的片段進行酶切鑒定。酶切體系為：PCR 產(chǎn)物 5 μl，10 × Buffer 2 μl，Xhol I 0.3 μl，加水補至 20 μl，37 ℃ 水浴鍋中酶解 2 h 后進行電泳檢測，并割膠回收相應目的條帶，連接到 T 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TOP10 感受態(tài)細胞，方法見文獻[7]，篩選重組質(zhì)粒測序的片段送至上海博尚生物技術(shù)公司測序，測序引物為 T5-4。

表 1 實驗引物設計

1.2.5 序列比對分析 測序結(jié)果在 NCBI 上分別與質(zhì)粒序列 P1A3 的 5’ 區(qū)和小鼠的基因組進行 Blast 比對（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome）。

2 結(jié)果

2.1 反向 PCR

構(gòu)建的質(zhì)粒載體經(jīng) Sal I 酶切線性化獲得 13 kb 的目的片段，經(jīng)顯微注射后獲得轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠。我們利用反向 PCR 的方法（圖 1）獲得 TF 整合位點的旁側(cè)序列，并選用合適的內(nèi)切酶，將基因組 DNA 切成片段大小適宜的 DNA 片段，即用 Bgl II 內(nèi)切酶作用于目的基因 5’ 端，得到的酶切片段為 704 bp（圖 2），然后又用 Bgl II 及 Bgl II 的同位酶 BamH I，BamH I + Bgl II 分別對基因組進行酶切。連接反應中用低濃度 DNA 和大體積的連接體系有利于線性 DNA 的環(huán)化。實驗結(jié)果表明：用 BamH I 和 Bgl II雙酶切的 DNA 片段在 150 μl 的連接體系經(jīng)過兩輪 PCR反應后，可以擴增出 2.5 kb 左右的特異片段（圖 3）。PCR

圖 1 反向巢式 PCR 示意圖

圖 2 載體 P1A3-TF-neo 的 5’ 端酶切位點及引物設計示意圖

圖 3 TFN-6 轉(zhuǎn)基因小鼠反向 PCR 結(jié)果

產(chǎn)物通過 Xhol 酶切后電泳鑒定，對 200 bp 特異片段的PCR 產(chǎn)物割膠回收，送至華大基因公司測序。

2.2 Blast 比對分析

圖 4 TFN-8 測序序列與小鼠基因組 Blast 的比對結(jié)果

低表達水平的 TFN-8 轉(zhuǎn)基因小鼠獲得 2.5 kb PCR 產(chǎn)物，用 T5-4 引物測序得到 1181 bp 序列，命名為 IPCR-1181，在 NCBI 上此序列分別與載體質(zhì)粒及小鼠基因組Blast 比對。結(jié)果 IPCR-1181 有 63 bp 與載體質(zhì)粒重疊，有 804 bp 與小鼠基因組 16 號染色體重疊（圖 4），整合在 16號染色體 A 區(qū) 1 帶（圖 5），位于基因 olfactory receptor 197 和 olfactory receptor 198 之間。用同樣的方法雙酶切高表達水平的 TFN-6 轉(zhuǎn)基因小鼠基因組 DNA，回收特異的 PCR 產(chǎn)物，T5-4 引物測序得 1007 bp序列，命名為 IPCR-1007，此序列在 NCBI 上分別于載體質(zhì)粒及小鼠基因組 Blast 比對。結(jié)果 IPCR-1007 有 55 bp 與載體質(zhì)粒重疊，有 933 序列與小鼠基因組 4 號染色體重疊（圖 6），整合在 4號染色體 A 區(qū) 1 帶（圖 7），位于基因 hypothetical protein LOC76947 precursor 和 tumor protein p53-inducible nuclear protein 之間。

圖 5 TFN-8 小鼠 hTF 基因在染色體定位示意圖

3 討論

外源基因在轉(zhuǎn)基因動物的子代傳遞中是否能穩(wěn)定遺傳，一直被轉(zhuǎn)基因動物研究者關(guān)注。Aigner 等[8]對轉(zhuǎn)酪氨酸激酶基因小鼠進行了長達 20 代的觀察，發(fā)現(xiàn)整合位點在子代傳遞中是高度穩(wěn)定的；魏慶信等[9]對轉(zhuǎn)綿羊啟動子/豬生長激素重組基因的轉(zhuǎn)基因豬研究表明外源基因可以傳遞給后代，且整合位點的遺傳也是相對穩(wěn)定的。但是，目前在轉(zhuǎn)基因動物研制過程中，仍需解決重組蛋白表達水平低及表達不穩(wěn)定等缺點，所以尋找高表達水平的轉(zhuǎn)基因動物整合位點，并研究整合位點旁側(cè)序列的特點和規(guī)律，為制備高表達的轉(zhuǎn)基因動物生物反應器奠定技術(shù)基礎將是當務之急。

通常擴增鄰近未知序列的方法有文庫篩選法、熱不對稱交錯 PCR（TAIL PCR）法、接頭連接 PCR（adaptor-ligation PCR）法、反向 PCR（inverse PCR，IPCR）法等。反向 PCR最早由 Ochman 等[10]發(fā)明，它可以對一個已知 DNA 順序兩側(cè)未知序列進行擴增。方法是：選擇已知 DNA 內(nèi)部沒有酶切位點的限制性內(nèi)切核酸酶對此片段 DNA 進行酶切，然后用 DNA 連接酶使之自身環(huán)化成環(huán)狀分子，設計與已知 DNA 序列兩端互補并向外擴增的引物，以該環(huán)狀DNA 分子為模板進行 PCR 擴增，得到已知序列的旁側(cè)序列。因此，高質(zhì)量、足夠量的 DNA 是反向 PCR 成功的必要條件。目前在已報道的文獻中，利用反向 PCR 擴增基因組中靶基因的旁側(cè)序列所需的基因組 DNA 最少量為：微生物基因組 500 ng[11]，動物基因組1 μg[12]。然而在對一些珍貴且微量的實驗材料，還有外源基因拷貝數(shù)少的基因組DNA 樣品等，就必須優(yōu)化反向 PCR 方法以提高效率，即建立用微量 DNA 分析靶基因旁側(cè)序列的技術(shù)平臺變得十分必要。

圖 6 TFN-6 測序序列與小鼠基因組 Blast 比對結(jié)果

圖 7 TFN-6 的整合基因在染色體定位示意圖

傳統(tǒng)的反向 PCR 要選用在已知序列中不存在酶切位點的內(nèi)切酶，并盡量選擇酶切效率高、特異性好、能產(chǎn)生黏性末端且常用的內(nèi)切酶。因為如果選擇產(chǎn)生平末端的內(nèi)切酶會給連接反應帶來額外的困難，而且內(nèi)切酶作用位點與左右邊界之間的距離是否適宜又是常規(guī) IPCR 的關(guān)鍵，太短可能存在片段之間的隨機連接而導致出現(xiàn)多個非特異擴增產(chǎn)物，同時還會影響序列分析，太長則會限制普通 PCR 聚合酶的擴增效果，例如在本文實驗中，顯微注射獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠外源目的片段為 10.5 kb，由于大多數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠往往是首尾連接的多拷貝形式整合入染色體基因組中[3]，這是常規(guī)的 IPCR 無法達到擴增效果。像 Martin 和 Mohn[13]使用改進的 IPCR：是選擇在已知序列中具有單一酶切位點的酶，將其切成兩部分，再單獨建立自連、PCR 體系成功克隆轉(zhuǎn)座子 Tn5（5810 bp）插入序列的旁側(cè)序列。而本文作者選擇 Bgl II 內(nèi)切酶獲得目的基因 5’ 端的 704 bp 片段（圖 2），并且與其同位酶 BamH I 一起對基因組進行雙酶切確保酶解 DNA 的片段大小適宜；另外，對分析樣品DNA 同時選用 Bgl II 和 BamH I 限制性內(nèi)切酶分別進行消化，分別進行 PCR 擴增，提供雙酶切的平行對照，結(jié)果證實雙酶切的擴增效果好。作者在試驗中用過量的限制性內(nèi)切酶，較大的酶切反應體系（150 μl）和長時間處理（37 ℃過夜），這對后續(xù)實驗極為重要；在酚氯仿抽提酶切產(chǎn)物時，無水乙醇沉淀步驟中加入不超過總體積 10% 的 3 mol/L的 NaAc，并且延長低溫沉淀的時間（–80 ℃ 過夜）減少產(chǎn)物的損失，也提高了回收的效率。

在酶切片段自連接反應中，若 DNA 濃度高或反應體積小，則可能容易生成多種串聯(lián)多聚體，這是反應中擴增出多個非特異產(chǎn)物的一個原因。有報道發(fā)現(xiàn)，在樣品DNA 濃度基本相同的情況下以 20 μl 體積中環(huán)化反應效果最佳[14]，本文實驗采用 150 μl 的連接體系，酶解片段濃度低于 2 ng/μl 的確獲得了較好的擴增結(jié)果，這與 Wang等[11]實驗結(jié)論一致。因此我們認為，線狀 DNA 在低濃度下有利于自身環(huán)化連接。為了確保獲得包括整合位點序列在內(nèi)的 PCR 產(chǎn)物，我們還對 PCR 條件進行了優(yōu)化，用巢式引物的設計降低了 PCR 反應過程中非特異條帶的擴增。并且用足量的 dNTP（0.8 mmol/L）和較長的延長時間（5 min）、PCR 反應循環(huán)數(shù)的增加（30 個），保證了 2 kb 以上的 PCR產(chǎn)物能順利擴增。

通過上述各個技術(shù)環(huán)節(jié)的優(yōu)化，本文用微量 DNA（200 ng）轉(zhuǎn)基因小鼠基因組 DNA 進行反向 PCR 法擴增出特異條帶，成功獲得高表達人轉(zhuǎn)鐵蛋白小鼠 TFN-6 和低表達小鼠 TFN-8 基因組中 TF 整合位點的旁側(cè)序列。按照此優(yōu)化 IPCR 法，我們還得到了它們的一系列子代轉(zhuǎn)基因小鼠 TF 整合位點的旁側(cè)序列并分別定位于 4 號和 16 號染色體。我們將利用這些結(jié)果尋找高表達水平的轉(zhuǎn)基因的整合位點，進一步分析整合位點旁側(cè)序列特征，包括各個堿基的比例，編碼框序列，DNA 二級結(jié)構(gòu)等，找出分布規(guī)律并利用定點整合技術(shù)構(gòu)建外源基因與高表達位點及旁側(cè)序列的高同源載體，進行制備特異、高表達水平轉(zhuǎn)基因動物－乳腺生物反應器和培育動物新品系，為動物生物反應器的研究制備作出一點貢獻。

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