慈凌坤, 江 力, 狄東偉, 張 軍, 盧云峰, 曹樹青

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,安徽合肥 230009)

硒是環(huán)境中一種重要的生命元素,隨著人類對硒生化功能認(rèn)識的日漸深入,促進(jìn)了植物硒的生理機(jī)能研究的進(jìn)一步發(fā)展。硒在植物體內(nèi)以無機(jī)硒和有機(jī)硒2種形式存在,大部分為有機(jī)硒形式,約占總量的80%以上,主要是硒代胱氨酸、硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸,硒以硒代含硫氨基酸形式直接參與蛋白質(zhì)合成,是重要的抗氧化酶類谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的組成部分[1]。硒在植物上的生理功能涉及到生長、發(fā)育、營養(yǎng)、代謝、產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等許多方面[2-3],硒發(fā)揮這些功能的作用機(jī)制仍然不完全清楚。

擬南芥是重要模式植物,由于近年來基因組學(xué)及遺傳學(xué)的發(fā)展,它的完整基因組已被成功測定,因此為新基因、基因功能方面的研究提供很多優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)采用不同質(zhì)量濃度的亞硒酸鈉(Na2 SeO3)處理野生型和突變體擬南芥,通過對其形態(tài)學(xué)及生理生化指標(biāo)的測定來篩選并鑒定耐硒突變體。本研究不僅為耐硒基因克隆及功能分析奠定基礎(chǔ),而且對于揭示植物耐硒的分子機(jī)理也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)所用擬南芥(Arabidopsis)生態(tài)型為Colum bia,野生型(W T)和突變體(Mutant)來自美國擬南芥種質(zhì)資源中心。

實(shí)驗(yàn)采用2種方法培養(yǎng)植株:①培養(yǎng)基培養(yǎng)[4]:種子經(jīng)0.1%HgCl2消毒3 min后,用無菌水沖洗4～5次,將種子點(diǎn)種在1.5%蔗糖和0.8%瓊脂的培養(yǎng)基中;并用封口膜封裝,于4℃條件下處理2 d后轉(zhuǎn)至光照為l00μmol/(m2·s2)、溫度為22～23℃的培養(yǎng)室中。②土壤培養(yǎng):種子播種于裝有土壤的盆缽中,置于光周期為光照16 h,黑暗8 h、光照為100 μmol/(m2·s2)、溫度為 22～ 23 ℃的培養(yǎng)室內(nèi),播種和開花時各澆1次營養(yǎng)液,并根據(jù)植株生長需要澆以適量水。

1.2 篩 選

[5-7]和預(yù)試驗(yàn),確定 50 mg/L Na2 SeO3為篩選質(zhì)量濃度。普通MS培養(yǎng)基上點(diǎn)種,育苗7 d后移入50 m g/L Na2SeO3選擇培養(yǎng)基,以根長作為篩選指標(biāo),選擇根長明顯長的作為候選突變體。

1.3 鑒 定

1.3.1 正常培養(yǎng)條件下的生長狀況

將野生型和突變體的種子直接播種于土壤和普通培養(yǎng)基中,不進(jìn)行任何處理,定期觀察拍照,比較突變體和野生型的生長狀況。

1.3.2 不同質(zhì)量濃度Na2 SeO3處理下的表型

設(shè)置 6 個質(zhì)量濃度(50、80、100、150、300、500 mg/L)Na2 SeO3和1個對照,對生長 21 d的擬南芥野生型和突變體葉片進(jìn)行涂抹,48 h后觀察不同質(zhì)量濃度下野生型和突變體的生長情況,拍照記錄并分析。

1.3.3 不同質(zhì)量濃度Na2 SeO3處理下的發(fā)芽率

設(shè)置 5 個質(zhì)量濃度(10 、20 、30 、40 、50 mg/L)Na2SeO3和1個對照(0 m g/L Na2SeO3的 MS培養(yǎng)基),分別將野生型和突變體種子點(diǎn)種在含有不同質(zhì)量濃度Na2 SeO3的培養(yǎng)基中,成5×10矩陣,封口后放入4℃冰箱中春化2 d后置于培養(yǎng)室中培養(yǎng),觀察記錄發(fā)芽率,直至第4天種子的發(fā)芽率不再變化為止。

1.3.4 蛋白質(zhì)量濃度和酶活性的測定

設(shè)置2個Na2 SeO3質(zhì)量濃度(50、80mg/L)和1個對照,將生長21 d的擬南芥葉片間隔24 h涂抹2次后,72 h后分別測定突變體和野生型葉片可溶性蛋白質(zhì)量濃度[8]和GSH-Px活性[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩 選

突變體的篩選如圖1所示,箭頭所示為根長明顯較長的植株,挑選出來移栽到土壤培養(yǎng)基中作為候選突變體培養(yǎng)。

圖1 突變體的篩選

2.2 候選突變體的土壤培養(yǎng)

候選突變體的整個生長周期如圖2所示。由于基因突變的復(fù)雜性,移栽到土壤培養(yǎng)基中的突變體,只有一部分能夠正常生長,經(jīng)過一段時間的培養(yǎng),最后有2株候選突變體成活,命名為vse1和vse2。

圖2 候選突變體的生長周期

2.3 野生型和突變體在正常生長條件下的表型

正常生長條件下,突變體和野生型的表型如圖3所示,由圖3可以看出,兩者的表型沒有明顯的區(qū)別。

圖3 野生型和突變體在正常生長條件下的表型

圖3下方是正常培養(yǎng)基中野生型和突變體培養(yǎng)28 d后的比較,顯示普通培養(yǎng)基中,突變體vse1、vse2與野生型沒有明顯的區(qū)別。

2.4 野生型和突變體在硒鹽脅迫下的表型

野生型和突變體vse1、vse2在不同質(zhì)量濃度Na2 SeO3處理下的表型比較如圖4所示。從圖4可看出,50mg/L Na2 SeO3處理后,突變體 vse1、vse2與野生型無明顯差異;80 m g/L Na2SeO3處理后,野生型的長勢明顯較突變體vse1、vse2差,且有部分枯萎;100 mg/L Na2 SeO3處理后,野生型基本枯萎,突變體vse1的長勢較好;150mg/L Na2 SeO3處理后,野生型和2個突變體大部分都已經(jīng)枯萎;300、500 mg/L Na2SeO3處理后,野生型和突變體全部枯萎。說明在 50～100 mg/L Na2 SeO3脅迫下,突變體vse1和vse2比野生型有較好的耐受性。

圖4 野生型和突變體在硒鹽脅迫下的表型

2.5 野生型和突變體在硒鹽脅迫下的發(fā)芽率

野生型和突變體在硒鹽脅迫下的發(fā)芽率如圖5所示。

圖5 野生型和突變體在硒鹽脅迫下的發(fā)芽率

從圖5可看出,普通MS培養(yǎng)基中,突變體vse1、vse2與野生型發(fā)芽率無差異;10 mg/L Na2 SeO3脅迫下,突變體 vse1、vse2與野生型發(fā)芽率無明顯差異;20、30、40 m g/L Na2SeO3脅迫下,野生型發(fā)芽率較突變體vse1、vse2差異很大;30 mg/L Na2SeO3脅迫下,突變體 vse1、vse2發(fā)芽率分別比野生型高出 18%、14%;40 mg/L Na2 SeO3脅迫下,突變體 vse1、vse2發(fā)芽率分別比野生型高出20%、12%;50 mg/L Na2 SeO3是篩選的臨界質(zhì)量濃度,突變體vse1、vse2發(fā)芽率高于野生型。

2.6 野生型和突變體在硒鹽脅迫下蛋白質(zhì)量比

野生型和突變體在硒鹽脅迫下可溶性蛋白質(zhì)量比的變化如圖6所示,與對照組相比,80mg/L Na2SeO3處理后,擬南芥突變體幼苗的可溶性蛋白質(zhì)量比明顯增加,vse1和vse2可溶性蛋白質(zhì)量比分別較對照組增加125%和188.9%,W T可溶性蛋白質(zhì)量比變化不明顯。這說明硒鹽脅迫下,突變體通過增加可溶性蛋白的質(zhì)量比增強(qiáng)了自身耐脅迫能力。

圖6 不同質(zhì)量濃度Na2 SeO 3處理下可溶性蛋白質(zhì)量比

2.7 野生型和突變體在硒鹽脅迫下酶活性

野生型和突變體在硒鹽脅迫下GSH-Px活性的變化如圖7所示,野生型和突變體的GSHPx活性均隨著Na2 SeO3質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)遞增趨勢,但野生型的增長趨勢小于突變體。80mg/L Na2 SeO3脅迫下,突變體 vse1、vse2 GSH-Px活性分別比對照增加 280%和219%,WT比對照增加134%。這說明硒脅迫下,耐硒突變體的GSH-Px的酶活性明顯增強(qiáng),且這種趨勢比野生型更加明顯。

圖7 不同質(zhì)量濃度Na2SeO3處理下GSH-Px活性的變化

3 討 論

突變體篩選方法是很重要的,越是專一的篩選條件,就越有機(jī)會直接獲得所期望的突變體?？梢圆捎迷谕庠次饔孟聰M南芥的根彎曲試驗(yàn)和發(fā)芽試驗(yàn),本實(shí)驗(yàn)采取以根長為指標(biāo)的篩選方法。實(shí)驗(yàn)中采用的擬南芥突變體庫是利用一個化學(xué)誘導(dǎo)激活啟動子/增強(qiáng)子的 T-DNA載體(XVE載體)構(gòu)建成的。由于T-DNA標(biāo)記或相鄰的基因可被XVE系統(tǒng)誘導(dǎo)激活,或被T-DNA破壞導(dǎo)致功能缺失,該突變體庫可以用于大規(guī)模篩選鑒定功能缺失性和功能獲得性突變體[10]。

有研究顯示,較低質(zhì)量濃度硒(50 mg/L)有利于蛋白質(zhì)的合成,微量元素硒對高等植物中GSH-Px活性影響是非常明顯的[9]。本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過80 mg/L N a2SeO3處理后,vse1和vse2葉片中的可溶性蛋白含量大幅增加,野生型、突變體vse1和vse2的酶活性分別增加了134%、280%和219%。

耐硒植物耐受高質(zhì)量濃度硒的機(jī)理在于它能夠減少硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸在細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)量濃度,這些氨基酸摻入到蛋白質(zhì)后可以對植物蛋白的結(jié)構(gòu)、肽鍵狀態(tài)產(chǎn)生影響,從而導(dǎo)致蛋白功能的損害,如果硒被轉(zhuǎn)化為非蛋白硒代氨基酸,諸如硒-甲基硒代半胱氨酸或硒代胱硫醚及二肽等,就可以減少硒的摻入[11-12]。本實(shí)驗(yàn)表明,在硒鹽脅迫下,突變體vse1和vse2的可溶性蛋白質(zhì)量比和GSH-Px的活性較野生型明顯提高,這與vse1和vse2耐硒能力較野生型強(qiáng)結(jié)果一致。但vse1和vse2以何種信號途徑調(diào)節(jié)其耐硒以及耐硒的分子機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1]徐輝碧.硒的化學(xué)、生物化學(xué)及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用[M].武漢:華中理工大學(xué)出版社,1994:190-192.

[2]李應(yīng)生,李亞男,陳大清.硒的生物學(xué)功能及植物的富硒機(jī)理[J].湖北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,23(6):476-480.

[3]羅世煒,張孟琴,吳永堯.植物硒的研究與利用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(14):4087-4088.

[4]M urashige T,Skoog F.A revised medium for rapid grow th and bioassays w ith tobacco tissue cu lture[J].Physiolgogia Plantarum,1962,15(3):473-497.

[5]Zhang Lihong,Ackley A R,Pilon-Smits E A H.Variation in selenium tolerance and accumulation among 19 Arabidopsis thaliana accessions[J].Jou rnal of Plant Physiology,2007,164:327-336.

[6]Tagmount A,Berken A,Terry N,et al.An essential role of S-adenosyl-l-m ethionine:l-methionine S-methyltransferase in selenium volatilization by plants.Methylation of selenomethionine to selenium-methyl-l-selenium-methionine,the precursor of volatile selenium[J].Plan t Physiology,2002,130(2):847-856.

[7]Shibagaki N,Rose A,M cDermott JP,et al.Selenate-resistan tmutants of Arabidopsis thaliana identify Su ltr 1;2,a sulfate transporter required for efficient transport of sulfate into roots[J].Plan t Journal,2002,29(4):475-486.

[8]Bradford M M.A rapid and sensitivemethod for the quantitation ofmicrog ram quantitiesof protein u tilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem,1976,72:248-254.

[9]周毅峰,吳永堯,唐巧玉.硒對大豆葉片谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶歧化酶活性的影響[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,23(2):127-129.

[10]張 健,徐金相,孔英珍,等.化學(xué)誘導(dǎo)激活型擬南芥突變體庫的構(gòu)建及分析[J].遺傳學(xué)報(bào),2005,32(10):1082-1088.

[11]陳大清.植物硒同化的研究進(jìn)展及其耐硒突變體的篩選[J].氨基酸和生物資源,2004,26(2):65-70.

[12]何桂平,張從合,陳金節(jié),等.雜交油菜及其親本對不同脅迫的響應(yīng)[J].合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010,33(8):1241-1244.