洪麗 賴晃文 熊敏

順鉑是臨床上常用的抗腫瘤藥物，其耳毒性已被人們充分認(rèn)識，但是至今尚無有效的防治方法。順鉑所致的耳蝸損傷表現(xiàn)為雙側(cè)進行性感音神經(jīng)性聽力下降，并且常常不可逆。順鉑耳蝸損傷機制尚不完全清楚，目前公認(rèn)活性氧(reactive oxygen species，ROS)在順鉑所致耳蝸損傷中起重要作用[1～3]。ROS作用于細(xì)胞蛋白、脂質(zhì)和DNA而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，其作用于質(zhì)膜產(chǎn)生磷脂過氧化產(chǎn)物，包括4-羥基-2-壬烯醛(4-HNE)等，4-HNE是一種醛脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，具有高度活性，能導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和死亡。由于ROS活性極高，存在時間短，難以檢測，故常以免疫組化方法檢測4-HNE以判斷ROS所致的氧化損傷[4]。燈盞花素具有抗氧化以及清除ROS的作用[5，6]，本研究擬觀察燈盞花素對順鉑所致耳蝸毒性的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選取30只健康雜色豚鼠,雌雄兼用,體重250 g左右,Preyer反射陽性,耳鏡檢查鼓膜未見異常。動物隨機分為正常對照組(A組) 、實驗對照組(B組) 、實驗組(C組)，每組10只。

1.2實驗方法

1.2.1各組動物用藥方法 A組不做任何處理；B組和C組一次性腹腔注射順鉑10 mg/kg，同時C組連續(xù)10天腹腔注射燈盞花素15 mg·kg-1·d-1, B組同時程腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2ABR 檢測方法 實驗前后每組動物均檢測ABR反應(yīng)閾。將清醒狀態(tài)的豚鼠置于特制固定架中,在隔聲屏蔽環(huán)境中行雙耳ABR檢測,記錄電極置于同側(cè)耳垂,參考電極置于對側(cè)耳垂,頭頂電極接地。采用Pathfinder I 型聽功能測試儀(Nicolet) 記錄,聲音由耳機通過與豚鼠外耳道耦合的塑料小管傳入,短聲刺激,帶通濾波為100～3 000 Hz，平均疊加次數(shù)為500～1 000次,以波Ⅲ為基準(zhǔn)判定反應(yīng)閾。

1.2.3耳蝸取材 最后一次檢測ABR后,各組豚鼠在全麻下開胸,以PBS 心臟灌流,在灌流液清亮?xí)r,改用4 %多聚甲醛灌注固定5 min。迅速取下雙側(cè)顳骨,左側(cè)耳蝸用于檢測4-HNE表達,右側(cè)耳蝸用于掃描電鏡檢查。將左側(cè)耳蝸置4 ℃ 4 %多聚甲醛液中,在解剖顯微鏡下摘除鐙骨,用細(xì)針于蝸頂鉆一小孔,輕輕以4 %多聚甲醛灌流耳蝸,耳蝸在4 %多聚甲醛中固定12 h 以上, PBS 漂洗數(shù)次,10 %EDTA 脫鈣,石蠟包埋,切片,每片厚度6 μm。將右側(cè)耳蝸置于4 ℃ 2 %戊二醛中,固定脫鈣后行掃描電鏡檢查。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色 三組豚鼠左側(cè)耳蝸切片以二甲苯及酒精脫蠟后,TBS 漂洗10 ×3 min,2 %雙氧水處理20 min ;TBS 漂洗10 ×2 min 后,0.2 % Triton - X處理10 min ;TBS 漂洗10 ×2 min ,5 %胎牛血清蛋白封閉60 min。加抗4-HNE抗體(以0. 8 %胎牛蛋白稀釋為1∶300 , LSBio, 從兔血清制備) 在4 ℃冰箱過夜。加入二抗(羊抗兔, 用TBS 稀釋為1∶400) 1 h ,TBS 漂洗后加入Strep - HRP (用TBS 稀釋為1∶100) 1 h ,TBS 漂洗4 ×10 min 后,用含有硫酸鎳的DAB顯色液顯色(陽性反應(yīng)呈藍黑色) ,顯色在光鏡下控制進行。陰性對照以0. 8 %胎牛蛋白代替抗4-HNE抗體,以實驗對照組豚鼠腎臟切片為陽性對照。對三組豚鼠耳蝸4-HNE染色進行半定量分析[7]。

1.2.5耳蝸掃描電鏡檢查 各組豚鼠右側(cè)耳蝸以2 %戊二醛固定、10 %EDTA 脫鈣后,PBS 漂洗,1 %鋨酸固定1 h。再次PBS 漂洗,剝除耳蝸骨殼,揭除前庭膜,暴露內(nèi)外毛細(xì)胞,以40 %～100 %酒精脫水各40 min ,于100 %丙酮液中過夜。二氧化碳臨界點干燥、粘托,真空噴金, 日立S-3000N型數(shù)字掃描電鏡觀察。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行t檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1ABR反應(yīng)閾 三組豚鼠ABR反應(yīng)閾見表1,造模前各組ABR反應(yīng)閾差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，順鉑腹腔注射后B、C 兩組豚鼠ABR反應(yīng)閾顯著升高，均明顯高于A組，B組明顯高于C組(P<0.01)。

表1 各組豚鼠造模前后ABR反應(yīng)閾(n=10只)

注：*與同組造模前比較，P<0.01；△與B組造模后比較，P<0.01

2.2免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果(表2) A組豚鼠耳蝸4-HNE反應(yīng)陰性。B組耳蝸4-HNE反應(yīng)呈強陽性(圖1a) ,而且在耳蝸的各回均呈陽性；在Corti器、Hensen細(xì)胞、Deiter細(xì)胞、內(nèi)外柱細(xì)胞、邊緣細(xì)胞4-HNE反應(yīng)均呈陽性;內(nèi)、外毛細(xì)胞4-HNE染色呈弱陽性；蝸神經(jīng)4-HNE染色在光鏡下呈陰性，4-HNE在血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的反應(yīng)呈強陽性。C組豚鼠耳蝸4-HNE染色呈弱陽性(圖1b), 其染色明顯較B組淺。可見4-HNE在順鉑損傷耳蝸中呈陽性表達, 燈盞花素對4-HNE活性有明顯的抑制作用。

表2 各組豚鼠耳蝸各部位4-HNE表達

注：-:陰性，+～++：弱陽性，++++：強陽性

2.3耳蝸掃描電鏡觀察 A組未觀察到毛細(xì)胞的損傷和缺失(圖2a)。B組耳蝸鉤端及基底回呈現(xiàn)多數(shù)大片狀外毛細(xì)胞缺失,內(nèi)毛細(xì)胞無明顯缺失(圖2b);第2、3回外毛細(xì)胞呈局灶性缺失。C組耳蝸鉤端及基底回呈散在外毛細(xì)胞缺失(圖2c) ,第2、3回呈個別外毛細(xì)胞缺失。

3 討論

目前順鉑的耳毒性機理不完全清楚，研究認(rèn)為是ROS損傷所致[1～3]。ROS使細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物消耗，谷胱甘肽是抗氧化通路中的重要物質(zhì)，在順鉑損傷小鼠耳蝸中的含量顯著下降，而細(xì)胞內(nèi)氧化自由基代謝產(chǎn)物丙二醛的含量顯著增加[8,9]。ROS與耳蝸細(xì)胞膜磷脂反應(yīng)可產(chǎn)生醛類物質(zhì)，其中4-HNE能引起耳蝸聽覺細(xì)胞和神經(jīng)元的凋亡[10，11]。

順鉑耳毒性的防治主要是應(yīng)用抗氧化劑治療[12]，也有報道血管內(nèi)皮生長因子能拮抗其耳毒性[13]。燈盞花素系菊科植物燈盞花中提取物，現(xiàn)代藥物研究證明,燈盞花素具有增加血流量、改善微循環(huán)、擴張血管、降低血粘度、降血脂、促纖溶、抗血栓、抗血小板聚集等作用。近幾年,隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)燈盞花素有抗氧化作用，臨床應(yīng)用范圍不斷拓寬[14]。

圖1 B、C兩組豚鼠耳蝸4-HNE表達(標(biāo)尺均為10 μm)a1: B組血管紋及耳蝸外側(cè)壁4-HNE為強陽性；a2: B組耳蝸外毛細(xì)胞4-HNE為強陽性；a3: B組耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞4-HNE為強陽性b1:C組血管紋及耳蝸外側(cè)壁4-HNE為弱陽性；b2: C組耳蝸外毛細(xì)胞4-HNE為弱陽性；b3: C組耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞4-HNE為弱陽性

圖2 A、B、C組豚鼠耳蝸掃描電鏡觀察(標(biāo)尺：10 μm)a：A組未見毛細(xì)胞缺失及損傷； b：B組見大片外毛細(xì)胞缺失； c：C組見局灶性外毛細(xì)胞缺失

4-HNE是耳蝸ROS氧化損傷的產(chǎn)物，是氧化損傷的一個可靠指標(biāo)[4]，4-HNE表達較強表明ROS氧化損傷重，其表達弱表明ROS氧化損傷輕。本實驗結(jié)果表明應(yīng)用順鉑后，4-HNE在B、C兩組耳蝸中均有表達,尤其在血管紋與螺旋神經(jīng)節(jié)表達呈強陽性。但應(yīng)用了燈盞花素的C組4-HNE的表達明顯較B組弱，且C組耳蝸毛細(xì)胞的損傷程度也明顯較B組輕，C組ABR反應(yīng)閾也明顯低于B組，說明燈盞花素能抑制4-HNE在順鉑損傷耳蝸中的表達，同時能減輕耳蝸外毛細(xì)胞損傷和ABR反應(yīng)閾閾移?？梢婍樸K觸發(fā)耳蝸形成ROS[1～3]，而ROS能激發(fā)耳蝸細(xì)胞的凋亡和壞死[11]，ROS在血管紋表達強陽性，能引起耳蝸血管紋的損傷,血管紋是整個耳蝸包括內(nèi)外毛細(xì)胞及支持細(xì)胞能量的主要來源[15，16],血管紋的損傷可導(dǎo)致耳蝸功能的失調(diào)。而燈盞花素通過抑制ROS的形成對順鉑致耳蝸的損傷起拮抗作用。

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