王 芳，吳 昱，劉玉林△， 劉子冬

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部藥品研發(fā)中心，西安 710032;2.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸外科，西安 710038)

柴桂安神膠囊是由柴胡、桂枝、川芎等12味中藥組成，有疏肝解郁、益氣健脾等作用，用于治療神經(jīng)官能癥所引起的失眠、健忘、偏頭痛、心悸、胸悶、焦慮等以及因神經(jīng)緊張而引起的胃腸功能紊亂，如腹瀉、惡心、腹脹等。為確保柴桂安神膠囊的質(zhì)量，本文對(duì)桂枝、川芎、白術(shù)進(jìn)行了薄層鑒別，同時(shí)用HPLC法測(cè)定了阿魏酸的含量，建立了可靠、準(zhǔn)確的質(zhì)量控制方法。

1 儀器及試藥

日本島津L20AB高效液相色譜儀，SPD-20A紫外檢測(cè)器，SK5200LH超聲儀，METTLER分析電子天平，硅膠G(青島海洋化工廠)。

桂枝對(duì)照藥材由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供(批號(hào)121191-200402);川芎對(duì)照藥材由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供(批號(hào)120918-200809);白術(shù)對(duì)照藥材由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供(批號(hào)120925-200708);阿魏酸對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供(批號(hào)110773-200611);甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑為分析純。柴桂安神膠囊由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥品制劑科提供(批號(hào)060305、070520、080329)。

2 定性鑒別

2.1 澤瀉、白術(shù)的顯微實(shí)驗(yàn)鑒別

取本品粉末2g輕輕研細(xì)，置顯微鏡下觀察，可見木栓細(xì)胞黃棕色，類圓形或多角形，壁薄，草酸鈣結(jié)晶多見，可檢出淀粉粒(澤瀉)，草酸鈣針晶細(xì)小，薄壁細(xì)胞含有菊糖，表面顯放射狀紋理，導(dǎo)管短小，為網(wǎng)紋及具緣紋孔(白術(shù))，符合藥典[1]。

2.2 桂枝薄層鑒別

取本品粉末10g加乙醇30ml密塞，時(shí)時(shí)振搖，放置30min濾過，濾液濃縮至 1ml，作為供試品溶液。取缺桂枝藥材的空白粉末10g，同法制成空白藥材對(duì)照溶液。另取桂枝對(duì)照藥材1g同法制成對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以石油醚(60℃ ～90℃)-乙酸乙酯(17∶3)為展開劑，展開、取出并晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照樣品無此斑點(diǎn)(圖1)。

2.3 川芎薄層鑒別

取本品粉末10g加乙醚50ml，超聲處理30min濾過、蒸干，用乙酸乙酯2ml溶解作為供試品溶液。取缺川芎藥材的空白粉末10g，同法制成空白藥材對(duì)照溶液。另取川芎對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑展開并取出、晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照樣品無此斑點(diǎn)(見圖2)。

2.4 白術(shù)薄層鑒別

取本品粉末 10g加正己烷 30ml，超聲處理30min，濾過，濾液濃縮至2ml，作為供試品溶液。取缺白術(shù)藥材的空白粉末10g，同法制成空白藥材對(duì)照溶液。另取白術(shù)對(duì)照藥材0.5g，同法制成0.5ml對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取對(duì)照溶液10ul，供試品溶液和空白藥材溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯=5∶1溶液為展開劑，板子在展開槽中飽和20min，展開、取出并晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱顯色。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照樣品無此斑點(diǎn)(見圖3)。

圖1 桂枝的薄層色譜圖

圖2 川芎的薄層色譜圖

圖3 白術(shù)的薄層色譜圖

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件

采用色譜柱為 Agilent ZE-C18柱(4.6 mm×250 mm)。流動(dòng)相∶甲醇-3%醋酸溶液(32∶68)，流速:1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為323nm，柱溫:室溫。

3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取阿魏酸對(duì)照品10mg，置50ml棕色量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度搖勻;精密量取3ml，置50ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，即得(每 1ml含阿魏酸 12μg)。

3.3 供試品溶液的制備

取本品20粒，研勻，精密稱取1g左右，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，密塞、搖勻并稱定重量，超聲處理30min放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻、靜置，取上清液用微孔濾膜(0.45um)濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性對(duì)照溶液的制備

取除川芎外的其余處方量藥材，按制備工藝方法制備不含川芎的陰性樣品。按3.3項(xiàng)下的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

3.5 干擾試驗(yàn)

在上述色譜條件下，分別取阿魏酸對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照液各10ul，注入色譜儀。樣品色譜圖中，在與阿魏酸對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，有一相同保留時(shí)間的色譜峰。而陰性對(duì)照品溶液在此保留時(shí)間處無干擾(見圖4～圖6)。

圖4 阿魏酸對(duì)照品溶液HPLC色譜圖1為阿魏酸

圖5 供試品溶液HPLC色譜圖 1、阿魏酸

圖6 陰性對(duì)照溶液HPLC色譜圖

3.6 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液 2、5、10、15、20、25、30、40、50ul分別進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，阿魏酸濃度(μg·ml－1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。得回歸方程:y=44262x－35145，r=0.998，阿魏酸在 0.03μg～0.5μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

3.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取上述濃度的對(duì)照品溶液10uL，連續(xù)進(jìn)樣5次，以阿魏酸的峰面積積分值計(jì)算，RSD為0.97%。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)(080329)樣品5份，每份約1.0g，按照供試品制備方法項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，阿魏酸平均含量為0.0152mg/粒，RSD 為 0.94%

3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(hào)(070520)樣品供試液，分別于2、4、6、8、12h 進(jìn)樣，阿魏酸平均含量為 0.0150mg/粒，RSD為0.95%。

3.10 回收率試驗(yàn)

表1顯示，采用加樣回收法，取已知阿魏酸含量樣品約0.5g(20070520)6份，分別加入一定量的阿魏酸對(duì)照品，按“3.3”方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

3.11 樣品測(cè)定

表2顯示，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10ul，注入高效液相色譜中測(cè)定。

表2 3批樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

4 討論

4.1 提取方法

本文在鑒別川芎項(xiàng)中，供試品提取分別應(yīng)用加熱回流法和超聲提取法。經(jīng)多次試驗(yàn)證明，2種方法均有很好的效果，可以有效、完全地提取出有效成分。但其超聲提取方法簡(jiǎn)便，易于操作，所以本方法選用了超聲提取方法。

4.2 提取成分

川芎含有生物堿(如川芎嗪)、酚性成分(阿魏酸)、揮發(fā)油以及內(nèi)酯素、維生素 A、葉酸、甾醇、蔗糖、脂肪油等，其中阿魏酸為川芎中的主要成分，本文分別用乙醇、甲醇[2]、70% 甲醇超聲[3]、酸水提乙醚萃取[4]、80%甲醇作為提取溶液。結(jié)果表明，80%甲醇提取效果好，雜質(zhì)少，方法簡(jiǎn)便。

4.3 實(shí)驗(yàn)研究

本文分別采用流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸溶液(25∶75)、甲醇-0.1%磷酸溶液(30∶60)、甲醇-3%醋酸溶液(32∶68)、乙腈-0.085% 磷酸溶液(17∶83)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中有醋酸可以抑制阿魏酸的分解[5、6]，用甲醇-3% 醋酸溶液(32∶68)可達(dá)到分離的最好效果。

[1]中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:68，168.

[2]丁 麗，劉宗武.反相高效液相色譜法測(cè)定不同溶媒川芎提取物中阿魏酸的含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18(7):1690-1691.

[3]張玉愛，吳澤榕，鄭起平，等.HPLC測(cè)定養(yǎng)血當(dāng)歸軟膠囊中阿魏酸的含量[J].中成藥，2006，28(4):599.

[4]張 健，金 墚，楊傳敏，等.HPLC測(cè)小兒運(yùn)脾合劑中川芎酸的含量[J].中國(guó)藥房，2005，16(24):1895.

[5]馮毅凡，等.高效液相色譜法測(cè)定參茸白風(fēng)丸中阿魏酸的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，1996，12(1):19.

[6]張 洪，等.反相高教液相色譜法測(cè)定歸芪口服液中阿魏酸的含量[J].藥物分析雜志，1996，15(1):17.