尚永輝 孫家娟 劉 靜 耿 薇

(咸陽(yáng)師范學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，咸陽(yáng) 712000)

藥物進(jìn)入人體后首先與血清白蛋白結(jié)合,通過(guò)血漿的存儲(chǔ)和運(yùn)輸,到達(dá)受體部位產(chǎn)生藥理作用[1]。通過(guò)測(cè)定血清白蛋白的變化,可為疾病診斷、療效觀察等提供有價(jià)值的資料及數(shù)據(jù)。熒光光譜法是目前研究蛋白質(zhì)與藥物分子相互作用的重要手段之一。

橙皮甙(Hesperidinum)屬黃酮類(lèi)化合物，具有抗炎，抗病毒以及降低毛細(xì)血管脆性，防止微血管破裂出血等多種功效，是目前治療高血壓和心肌梗塞的常用藥物之一。實(shí)驗(yàn)在pH 7.40的Tris-HCl緩沖介質(zhì)中運(yùn)用熒光光譜技術(shù)研究了橙皮甙與BSA的相互作用，并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了初步分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

熒光分光光度計(jì)：RF-5301型，日本島津公司；

電子分析天平：HA-180MF型，日本日立公司；

牛血清白蛋白(BSA)：Amresco.0930，分子量為65 000；

橙皮甙：對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；

Tris-HCl緩沖溶液：pH 7.40；

Tris、HCl：分析純；

實(shí)驗(yàn)用水為雙重蒸餾水；

以Tris-HCl緩沖溶液為溶劑分別配制濃度均為1.0×10-3mol/L的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液和橙皮甙標(biāo)準(zhǔn)溶液，兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液均在0～4℃的冰箱中保存，實(shí)驗(yàn)所需濃度由此稀釋而得。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL比色管中依次加入Tris-HCl緩沖溶液2.0 mL、1.0×10-3mol/L BSA溶液0.1 mL以及一定量橙皮甙溶液，采用雙重蒸餾水稀釋至刻線(xiàn)，搖勻，分別在295、303、310、315K 4個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度下恒溫1 h，采用1 cm石英比色皿，以285 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，繪制300～500 nm的熒光光譜和Δλ=60 nm，Δλ=15 nm的同步熒光光譜，測(cè)定中入射狹縫與出射狹縫寬度均為3 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光猝滅光譜

按照1.2方法分別測(cè)定了實(shí)驗(yàn)溫度下橙皮甙對(duì)BSA的熒光猝滅光譜(310 K的熒光光譜見(jiàn)圖1)。

cBSA=0.1×10-4 mol/L； c Hesperidinum 從1到16依次為0、0.2、……、2.8、3.0 μmol/L圖1 橙皮甙對(duì)BSA熒光光譜的影響(T=311K)

由圖1可知，隨著橙皮甙濃度的逐漸增加，BSA的熒光強(qiáng)度逐漸降低，這是由于蛋白質(zhì)中存在的色氨酸和酪氨酸使其具有內(nèi)源熒光，當(dāng)固定BSA的量不斷增加橙皮甙的濃度時(shí), 橙皮甙與BSA之間的相互作用導(dǎo)致BSA內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律地猝滅。

2.2 熒光猝滅機(jī)理及猝滅常數(shù)的測(cè)定

引起B(yǎng)SA熒光猝滅的原因有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。兩種過(guò)程均遵從Stern-Volmer方程[2]，隨溫度的升高動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)逐漸增大，而靜態(tài)猝滅常數(shù)逐漸減小，由此可判斷熒光猝滅類(lèi)型。

根據(jù)不同溫度下橙皮甙對(duì)BSA猝滅的Stern-Volmer曲線(xiàn)，可以得到不同溫度下橙皮甙對(duì)BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程及猝滅常數(shù)，數(shù)據(jù)列于表1。

表1 不同溫度下橙皮甙對(duì)BSA的猝滅常數(shù)

注：表中F0，F(xiàn)分別表示加入猝滅劑橙皮甙前后BSA的熒光強(qiáng)度，[Q]為猝滅劑橙皮甙濃度，Kq為猝滅常數(shù)。

隨溫度升高猝滅常數(shù)(Kq)逐漸增加，表明橙皮苷對(duì)BSA的猝滅過(guò)程應(yīng)該是以動(dòng)態(tài)猝滅為主。各類(lèi)猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)約為2×1010L/(mol·s),而從表1結(jié)果來(lái)看,Kq均大于該值，由此考慮，猝滅過(guò)程應(yīng)為靜態(tài)猝滅，但考慮到離子強(qiáng)度是影響猝滅系數(shù)的重要因素，實(shí)驗(yàn)采用0.1 mol/L NaCl以控制溶液離子強(qiáng)度，筆者認(rèn)為Kq的增大可能是離子強(qiáng)度影響的結(jié)果[3]。

2.3 牛血清白蛋白與橙皮甙結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)及作用力

根據(jù)文獻(xiàn)計(jì)算出310、315K溫度下橙皮甙與BSA作用的熱力學(xué)參數(shù)自由能變?chǔ)=-28.92 kJ/mol(310K)，ΔG=-27.34 kJ/mol(310K)，焓變?chǔ)=70.71 kJ/mol，熵變?chǔ)=316.29 J/mol，由ΔG<0得知橙皮甙與BSA的結(jié)合過(guò)程是自發(fā)進(jìn)行的，根據(jù)Ross等[4]總結(jié)出的判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律，ΔH>0和ΔS>0表明橙皮甙與BSA結(jié)合過(guò)程以疏水作用力為主。

2.4 橙皮甙與BSA的表觀結(jié)合常數(shù)Kb以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

當(dāng)小分子與大分子結(jié)合時(shí)，其表觀結(jié)合常數(shù)Kb與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n由下式求出[5]:

lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[Q]

在實(shí)驗(yàn)溫度下繪制不同濃度的橙皮甙與BSA的lg[(F0-F)/F]～lg[Q]的雙對(duì)數(shù)圖，根據(jù)截距和斜率求得相應(yīng)的Kb和n，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可看出,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n接近1，表明橙皮甙與BSA可形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。橙皮甙與BSA的結(jié)合常數(shù)Kb值在104數(shù)量級(jí)以上,表明橙皮甙與BSA之間有較強(qiáng)的結(jié)合作用，可以被蛋白質(zhì)運(yùn)輸和儲(chǔ)存。

表2 橙皮甙與BSA的表觀結(jié)合常數(shù)Kb以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

2.5 同步熒光光譜

由于芳香氨基酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)與其所處環(huán)境極性有關(guān),可由發(fā)射波長(zhǎng)的改變可判斷BSA中芳香氨基酸殘基所處微環(huán)境的變化情況。Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步熒光光譜分別顯示酪氨酸殘基和色氨酸殘基的光譜特征[4]。固定BSA濃度為1.0×10-5mol/L，逐漸改變橙皮甙濃度分別測(cè)定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步熒光光譜(圖略)，由圖可知，酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度均隨橙皮甙濃度的增加而產(chǎn)生猝滅，酪氨酸殘基，色氨酸熒光發(fā)射峰的位置均無(wú)明顯移動(dòng),表明橙皮甙對(duì)蛋白質(zhì)微環(huán)境構(gòu)象的改變不大[6]。色氨酸熒光發(fā)射波長(zhǎng)與BSA的熒光發(fā)射波長(zhǎng)接近,且色氨酸殘基熒光猝滅程度比酪氨酸殘基更顯著，表明BSA的熒光主要由色氨酸殘基所貢獻(xiàn)，結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基。

3 結(jié)語(yǔ)

采用熒光光譜技術(shù)研究了橙皮甙與BSA的相互作用。結(jié)果表明：橙皮甙對(duì)BSA的熒光猝滅屬于動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程。兩者之間的相互作用是靠疏水作用力相結(jié)合的一個(gè)自發(fā)過(guò)程，應(yīng)用同步熒光光譜考察了橙皮甙對(duì)BSA構(gòu)象的影響。

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