羅瑞峰 羅小玲 馬小寧

[農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(石河子)，石河子 832000]

孔雀石綠(MG)和結(jié)晶紫(CV)是一種三苯甲烷類染料，極易溶于水，水溶液呈藍(lán)綠色。自1993年起孔雀石綠和結(jié)晶紫開(kāi)始作為驅(qū)蟲(chóng)劑、殺菌劑、防腐劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中出現(xiàn)，而后因?yàn)榫哂袃r(jià)格低廉、效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于預(yù)防與治療各類水產(chǎn)動(dòng)物的水霉病、爛鰓病以及寄生蟲(chóng)病等。但隨著研究的深入，孔雀石綠和結(jié)晶紫潛在的致癌、致畸、致突變等毒副作用[1]受到人們關(guān)注，人食用了殘留孔雀石綠和結(jié)晶紫的魚(yú)會(huì)對(duì)人體健康造成巨大威脅。

近幾年，人們對(duì)水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝產(chǎn)物的研究非?；钴S，關(guān)于檢測(cè)方法的報(bào)道文獻(xiàn)就有上百篇，國(guó)標(biāo)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有4個(gè)[2-5]，基本原理是用乙腈-緩沖鹽混合液提取，再用二氯甲烷液-液萃取，固相提取小柱凈化，上儀器測(cè)定。但這幾種方法在實(shí)際操作時(shí)會(huì)出現(xiàn)一些困難，比如：(1)液-液萃取時(shí)乳化較為嚴(yán)重，無(wú)法分層；(2)二氯甲烷層具有忽上忽下的現(xiàn)象；(3)提取液濃縮時(shí)暴沸；(4)樣品處理液有分層現(xiàn)象；(5)上機(jī)標(biāo)準(zhǔn)溶液的定容介質(zhì)和分析物的靈敏度有關(guān)。筆者對(duì)幾種檢測(cè)方法的前處理進(jìn)行了比較，總結(jié)了這幾種標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，對(duì)其中的前處理方法進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，建立了快速篩選方法，同時(shí)探討了測(cè)定過(guò)程中應(yīng)注意的一些問(wèn)題。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Waters 2695型，配Waters 2475熒光檢測(cè)儀，美國(guó)Waters公司；

超聲波清洗器：美國(guó)Waters公司；

漩渦振蕩器：XW-80A型，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：H2500R-2型，長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-210型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；

孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品：已知含量不小于97.0%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

無(wú)色孔雀石綠(LMG)標(biāo)準(zhǔn)品：已知含量不小于99.0%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)品：已知含量不小于97.0%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

無(wú)色結(jié)晶紫(LCV)標(biāo)準(zhǔn)品：已知含量不小于99.0%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

乙腈：色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；

乙酸銨：優(yōu)級(jí)純；

二氯甲烷、鹽酸羥胺、對(duì)甲苯磺酸、冰乙酸、二甘醇：分析純；

混合提取溶液配制：稱取鹽酸羥胺13.4 g、對(duì)甲苯磺酸0.84 g、乙酸銨2.6 g溶于500 mL蒸餾水中，用冰乙酸調(diào)節(jié)溶液pH值為4.5；

硼氫化鉀溶液:0.2 moL/L,稱取0.54 g硼氫化鉀溶于燒杯中，定容于50 mL的容量瓶中；

試驗(yàn)用水為符合GB/T 6682-1992規(guī)定的一級(jí)水。

1.2 儀器工作條件

Symmetry shieldRP C18不銹鋼色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1 moL/L乙酸銨溶液(pH 4.5,體積比為80∶20)，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾；流動(dòng)相流速：1.0 mL/min；柱溫：40.0℃；進(jìn)樣體積：50 μL；激發(fā)波長(zhǎng)：265 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：360 nm。按上述條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，得標(biāo)準(zhǔn)譜圖見(jiàn)圖1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1)樣品提取

稱取5 g樣品(精確至0.01 g)于50.0 mL離心管內(nèi)，加入混合提取液10 mL，使用渦漩攪拌器充分混勻，加20 mL乙腈，以10 000 r/min勻漿2 min，放入-18℃的冰箱中冷凍30 min，將離心管放入高速冷凍離心機(jī)，于-5℃，以18 000 r/min離心15 min。中間清液用虹吸管轉(zhuǎn)移至250 mL的分液漏斗中。離心管中再次加入混合提取液10 mL、乙腈20 mL，重復(fù)上述操作，合并提取液，分液漏斗中加入10 mL硼氫化鉀溶液，充分混勻，放置反應(yīng)10 min。

圖1 無(wú)色孔雀石綠及無(wú)色結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

(2)樣品凈化

在250 mL的分液漏斗中加入飽和氯化鈉溶液30 mL，振蕩后靜置分層，取上層有機(jī)相于雞心瓶，用30 mL乙腈重復(fù)提取一次鹽溶液，合并有機(jī)層，于45℃旋轉(zhuǎn)蒸至近干，用少量乙腈溶解備用。丙基磺酸萃取小柱安裝在固相萃取裝置上，用5 mL乙腈活化小柱后，把雞心瓶中的溶液移到小柱上過(guò)濾，用5 mL乙腈洗滌雞心瓶?jī)纱危严礈煲阂来瓮ㄟ^(guò)小柱，吹丙基磺酸萃取小柱近干，用10 mL甲醇-乙酸乙酯-氨水(體積比為5∶4.5∶0.5)洗脫，收集在雞心瓶中，加0.5 mL乙酸中和，于45℃旋轉(zhuǎn)蒸至近干，用乙腈定容至1.0 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，上機(jī)。

(3)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取適量的孔雀石綠和結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)品，精確至0.1 mg，用乙腈配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃避光保存。用乙腈稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成1 μg/mL的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于-18℃避光保存。上機(jī)時(shí)準(zhǔn)確吸取一定量孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，各加入0.05 mL硼氫化鉀溶液(0.2 moL/L)，用乙腈準(zhǔn)確定容至5 mL，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液系列為0.2、0.5、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的改進(jìn)

幾種標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)二氯甲烷反提步驟的分層不穩(wěn)問(wèn)題，由于不同水產(chǎn)品機(jī)體中蛋白質(zhì)、脂肪含量和結(jié)構(gòu)不同，檢測(cè)基質(zhì)有較大差異，加入二氯甲烷進(jìn)行反提的步驟常發(fā)生分層不明顯、二氯甲烷層忽上忽下的現(xiàn)象，易誤判造成所需要的二氯甲烷層被舍棄而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。在GB/T 20361、GB/T 19857、SC 3021和SN/T 1479中都提到加入氧化鋁，用來(lái)除去蛋白質(zhì)和脂肪，實(shí)驗(yàn)表明，加入氧化鋁對(duì)回收率有較大影響，幾種標(biāo)準(zhǔn)方法在提取液濃縮時(shí)常見(jiàn)瓶中有白色泡沫產(chǎn)生且易暴沸沖出，雞心瓶?jī)?nèi)壁有大量脂肪，有時(shí)會(huì)留有殘液很難蒸干，暴沸的原因可能是提取液中含有一定量的蛋白質(zhì)。為克服前處理時(shí)出現(xiàn)的這些困難，用冷凍和超高速離心的方法除去基質(zhì)中的蛋白質(zhì)和脂肪，實(shí)驗(yàn)效果理想。

2.2 凈化方法的改進(jìn)

本方法在分液漏斗中加入飽和氯化鈉溶液，使溶液更容易分層，由于鹽析作用，使極性弱的LMG和LCV更易轉(zhuǎn)入有機(jī)相。研究還發(fā)現(xiàn)，如果溶液中有MG和CV，加入飽和氯化鈉溶液提取會(huì)使MG和CV的回收率顯著降低，可能是由于MG和CV極性較強(qiáng)，在水溶液中以離子形態(tài)存在，加入飽和氯化鈉溶液，使溶液的離子強(qiáng)度增加，對(duì)MG和CV發(fā)生了離子化效應(yīng)，使MG和CV更容易溶解在水溶液中。本方法洗脫時(shí)采用堿性甲醇+乙酸乙酯的混合液，研究顯示，10 mL堿性甲醇+乙酸乙酯混合液能把分析物完全洗脫。按國(guó)標(biāo)的洗脫方法對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率較低，根據(jù)不同廠家的PRS柱，洗脫液在5～10 mL時(shí)才能完全洗脫。

2.3 回收率影響因素

待分析物質(zhì)對(duì)光、熱和氧氣較為敏感，容易發(fā)生去甲基化和氧化降解，尤其是LMG和LCV。樣品提取時(shí)，加入還原劑鹽酸羥胺有助于防止待測(cè)物的降解氧化,加入離子對(duì)試劑對(duì)甲苯磺酸，有利于MG、CV形成離子對(duì)，增加乙腈對(duì)這兩種物質(zhì)的提取效率。樣液濃縮時(shí)，比較了45℃條件下 N2吹干和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮待測(cè)組分的損失率。結(jié)果表明，采用N2直接吹干，各組分的損失率超過(guò)50%；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮的損失小，回收率大于95%。

2.4 線性方程與檢出限

用熒光檢測(cè)器測(cè)定0.2～20 μg/L范圍的無(wú)色孔雀石綠、無(wú)色結(jié)晶紫，以各組分的峰面積(y)對(duì)相應(yīng)濃度(c,μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，無(wú)色孔雀石綠的線性方程為y=2.015×107c-5.24×102，無(wú)色結(jié)晶紫的線性方程為y=3.872×107c-1.52×102,各組分的相關(guān)系數(shù)r≥0.998。

以樣品空白的3倍噪聲計(jì)算檢出限(LOD)，10倍噪聲計(jì)算定量限(LOQ)，得出無(wú)色孔雀石綠和無(wú)色結(jié)晶紫檢出限為0.5 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg。

2.5 回收率及精密度試驗(yàn)

通過(guò)陰性樣品加標(biāo)驗(yàn)證該方法的回收率及精密度，孔雀石綠、結(jié)晶紫總量(全部還原為無(wú)色孔雀石綠和無(wú)色結(jié)晶紫)的加標(biāo)回收率為78.3%～100.9%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～7.1%。回收率和精密度基本能滿足要求，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

討論了水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，提出了一套簡(jiǎn)單實(shí)用的前處理方法，對(duì)不同水產(chǎn)品的處理均達(dá)到預(yù)期的效果，有較好的適應(yīng)性，是一種通用的快速檢測(cè)方法。該法有利于大批量樣品的測(cè)定，而且該方法靈敏度好、準(zhǔn)確度高，精密度好，是值得推廣的水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫的檢測(cè)方法。

[1] 翟毓秀,張翠,寧勁松，等.水產(chǎn)品中的孔雀石綠殘留及其研究概況[J].海洋水產(chǎn)研究，2007,28(1)：101-108.

[2] SC 3021-2004 無(wú)公害食品 水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的測(cè)定 液相色譜法[S].

[3] GB/T 20361-2006 水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定高效液相色譜熒光檢測(cè)法[S].

[4] GB/T 19857-2005 水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定[S].

[5] SN/T 1479-2004 進(jìn)出口水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量檢驗(yàn)方法[S].