衣聞聞 全 燦 金君素

(1.北京化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，北京 100029; 2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)計(jì)量與分析科學(xué)研究所，北京 100013)

蛋白同化激素(Anabolic androgenic steroids，AAS)是具有環(huán)戊烷并多氫菲母核的類固醇類激素類藥物，主要為具有蛋白同化作用的雄性激素，能夠促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，在特定的飼喂期間可引起蛋白質(zhì)沉積，提高飼料轉(zhuǎn)化率[1],因此在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中得到廣泛的應(yīng)用。然而，濫用類固醇類激素會(huì)造成其在動(dòng)物組織中不同程度的殘留，從二十世紀(jì)八、九十年代開始，歐盟等西方發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)類固醇激素類藥物殘留進(jìn)行了嚴(yán)格的限制[2]，我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布的第235號(hào)文件中規(guī)定丙酸睪酮、苯丙酸諾龍、甲基睪酮、群勃龍等在動(dòng)物性食品中的最高殘留限量為不得在動(dòng)物性食品中檢出[3]。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)動(dòng)物組織中類固醇類激素的檢測(cè)方法研究較多,主要有高效液相色譜法(HPLC)[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[5-7]和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[8-12]。其中，氣相色譜-質(zhì)譜法需要對(duì)類固醇類激素進(jìn)行衍生化，且衍生化過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，重復(fù)性差，且目前存在的衍生化試劑均不能對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行充分衍生[13]。

筆者以牛肉組織為原料，用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定其中美雄酮、諾龍、勃地龍、甲基睪酮、丙酸睪酮和丙酸諾龍的含量，以期建立樣品處理簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性好的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：Agilent 1100型，美國(guó)Agilent公司；

冷凍離心機(jī)：3K15型，美國(guó)Sigma公司；

漩渦混勻儀：MS3 Minishaker型，德國(guó)IKA公司；

電子天平：CP324s型，德國(guó)Sartorius公司；

水浴型氮吹儀：KL512型，美國(guó)Organomation公司；

超聲儀：5510型，美國(guó)Branson公司；

美雄酮[GBW(E)100085]、諾龍[GBW(E)100088]、勃地龍[GBW(E)100090]、甲基睪酮[GBW(E)100086]、丙酸睪酮[GBW(E)100087]、丙酸諾龍[GBW(E)100089]：均為溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、丙酮、乙酸乙酯：HPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司；

實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；

牛肉由北京某超市隨機(jī)購(gòu)得。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液

取適量溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇稀釋，配制成6種目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度均為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于-20℃的冰箱中保存。通過(guò)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液分別得到質(zhì)量濃度為2.0 mg/L和10.0 mg/L的混合校準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

稱取絞碎后的牛肉(5±0.5)g于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋30 s，超聲提取10 min，以8 000 r/min離心10 min，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，再用10 mL乙腈重復(fù)提取兩次，合并上層有機(jī)相，用40℃氮?dú)獯蹈桑尤? mL甲醇溶液，渦旋30 s，全部溶解后，-20℃放置30 min，4℃時(shí)以10 000 r/min離心10 min，取適量上層液體過(guò)0.2 μm微孔濾膜，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

1.4 儀器條件

色譜柱：Hypersil Gold(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為甲醇；梯度洗脫程序：流動(dòng)相B初始值為55%，15 min內(nèi)B由55%變化至70%，15～18 min，B由70%變化至90%，18～23 min，B由90%變化至55%；流速為1.0 mL/min。

1.5 校準(zhǔn)曲線

取不同量的類固醇類激素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別用甲醇配制成0.25、0.5、1.0、1.5、2.5、5.0、10.0 mg/L的校準(zhǔn)溶液。以待測(cè)物色譜圖的峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得直線回歸方程。

1.6 回收試驗(yàn)

分別向空白牛肉中添加質(zhì)量濃度為2.0 mg/L和10.0 mg/L的混合校準(zhǔn)工作液1 mL，制得0.4 mg/kg和2.0 mg/kg添加水平的樣品，按1.3方法處理，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，將測(cè)得的目標(biāo)物峰面積代入校準(zhǔn)曲線，計(jì)算測(cè)得的目標(biāo)物濃度。

1.7 檢出限和定量限

取適量混合校準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，分別根據(jù)3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算方法的檢出限和定量限。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)本課題組前期的研究成果，6種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)集中在239～245 nm,因此在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)分別進(jìn)樣，考察6種目標(biāo)化合物的響應(yīng)值之和，梯度為1 nm，結(jié)果見表1。由表1可知，6種目標(biāo)化合物的響應(yīng)值在245 nm處達(dá)到最大值，超過(guò)245 nm又有所下降，因此選用245 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表1 6種目標(biāo)化合物在各波長(zhǎng)下的響應(yīng)值之和

2.2 流動(dòng)相的選擇

考察了梯度洗脫條件下，不同組成流動(dòng)相的洗脫效果，比較了不同比例的乙腈-水和甲醇-水的洗脫效果。乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)6種目標(biāo)化合物的出峰時(shí)間整體提前，分離效果較好，但是乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)使得樣品中更多雜質(zhì)被洗出，且干擾目標(biāo)化合物的峰形。甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)化合物與雜質(zhì)峰能很好地分離，且6種目標(biāo)化合物在23 min內(nèi)可以很好地分離，因此選擇甲醇-水為流動(dòng)相，其分離效果見圖1。

1—勃地龍； 2—諾龍； 3—美雄酮； 4—甲基睪酮；5—丙酸諾龍； 6—丙酸睪酮圖1 標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的HPLC色譜圖

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

比較了叔丁基甲醚、乙腈、乙酸乙酯、丙酮和甲醇5種有機(jī)溶劑的提取效果，其中乙腈和乙酸乙酯的提取液中目標(biāo)化合物的回收率最高，5種有機(jī)溶劑分別作為提取溶劑時(shí)提取的目標(biāo)化合物回收率見表2。乙酸乙酯的提取液背景雜質(zhì)較多，而乙腈提取的背景干擾較少，譜圖更加清晰，因此選用乙腈為提取溶劑。5種有機(jī)溶劑分別作為提取溶劑提取后的色譜圖見圖2。

表2 5種有機(jī)溶劑分別用作提取溶劑時(shí)6種目標(biāo)化合物的回收率

1—勃地龍； 2—諾龍； 3—美雄酮； 4—甲基睪酮；5—丙酸諾龍； 6—丙酸睪酮圖2 5種有機(jī)溶劑分別提取的目標(biāo)化合物液相色譜圖

脫脂是動(dòng)物基質(zhì)前處理中必不可少的步驟，文獻(xiàn)[11]報(bào)道多采用正己烷脫脂法，本實(shí)驗(yàn)也嘗試了正己烷除脂法，但由于類固醇類激素均是脂溶性激素，在正己烷中有一定的溶解度，造成目標(biāo)物回收率偏低[14]。經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)最終采用低溫冷凍脫脂[6]的前處理方法，在-20℃下用甲醇復(fù)溶后進(jìn)行30 min低溫冷凍處理，溶出脂肪，通過(guò)離心將脂肪除去，樣品前處理快速簡(jiǎn)捷。加標(biāo)水平為2.0 mg/kg的6種蛋白同化類固醇類激素的提取色譜圖見圖3。圖3中同時(shí)給出了空白牛肉的色譜圖，通過(guò)對(duì)比可以看出，所采購(gòu)的牛肉中不含有6種目標(biāo)化合物。

1—勃地龍；2—諾龍；3—美雄酮；4—甲基睪酮；5—丙酸諾龍；6—丙酸睪酮圖3 空白牛肉和加標(biāo)量為2.0 mg/kg的HPLC色譜圖

2.4 線性方程與檢出限

按1.5求得線性回歸方程，按1.7計(jì)算方法的檢出限和定量限，線性回歸方程、檢出限和定量限結(jié)果見表3。在0.25～10 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，美雄酮、諾龍、勃地龍、甲基睪酮、丙酸睪酮和丙酸諾龍等6種類固醇類激素的線性良好，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.999。

表3 6種目標(biāo)化合物的線性方程、線性范圍、檢出限和定量限

2.5 回收試驗(yàn)與精密度試驗(yàn)

6種類固醇類激素類藥物在0.4 mg/kg和2.0 mg/kg的添加水平下，平均回收率為84.1%～100.2%，每個(gè)添加水平下平行測(cè)定5個(gè)樣品，精密度為0.5%～3.5%，結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

建立了HPLC同時(shí)快速測(cè)定牛肉組織中美雄酮、勃地龍、諾龍、甲基睪酮、丙酸諾龍和丙酸睪酮6種蛋白同化類固醇類激素殘留量的方法。樣品的前處理簡(jiǎn)便、快速，方法的靈敏度好，精密度高，完全適用于動(dòng)物肌肉組織中蛋白同化類固醇類激素多殘留的分析檢測(cè)。

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