許 倩 盛靈慧 李保山 黃 崢

(1.北京化工大學(xué)化工資源有效利用國家重點實驗室，北京 100029； 2.中國計量科學(xué)研究院，北京 100013)

根據(jù)單雙鍵組成脂肪酸可分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸3種。流行病學(xué)研究表明，脂肪酸與胰島素抵抗、冠狀動脈疾病、高血壓、肥胖等慢性病以及乳腺癌、結(jié)腸癌等疾病的發(fā)生具有一定的關(guān)聯(lián)性。人體血清中總脂肪酸的組成及其水平是人體攝入脂肪酸和代謝后的重要指標(biāo)，進(jìn)行人體血液中的脂肪酸組分分析有助于健康狀況評價[1,2]。目前脂肪酸的測定通常采用衍生的方法對脂肪酸進(jìn)行甲酯化反應(yīng)后通過氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜法分析[3-5]，但衍生化的過程不僅花費大量的時間，而且會對樣品造成損失。因此筆者建立了一種快速、準(zhǔn)確的定量方法，此方法使用Dole提取法[6]，提取的樣品直接進(jìn)行分析，無需衍生化，用HPLC-MS分離、定量了人血液中游離脂肪酸，并采用氘代十六烷酸為內(nèi)標(biāo)物測定了回收率。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(LC-MS-MS)：包括高效液相色譜儀(Agilent 1200型，美國Agilent公司)和串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(Agilent 6410型，美國Agilent公司)；

電子分析天平：XP65型，d=0.01 mg，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

7種脂肪酸(十三烷酸、十四烷酸、十七烷酸、油酸、硬脂酸、二十烷酸和二十二烷酸)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：中國計量科學(xué)研究院生物實驗室制備；

11種脂肪酸(十二烷酸、十六烷酸、十六碳一稀酸、亞油酸 、十八碳三稀酸、花生酸、二十碳一稀酸、二十碳二稀酸、花生四稀酸、二十碳五稀酸、二十二碳六稀酸)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：購自美國Sigma-Aldrich公司；

血清樣品：解放軍醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院；

甲醇：分析純，美國J. T. Baker公司；

磷酸：分析純，北京化學(xué)試劑公司；

實驗所用其它試劑均為分析純；

實驗用水為millipore超純水。

1.2 樣品處理

取1 mL血清于15 mL離心管中，加入50 μL 同位素十六烷酸內(nèi)標(biāo)溶液(10 mg/L)，加入5 mL混合液(異丙醇-正己烷-2 mol/L磷酸，體積比40∶10∶1)，室溫反應(yīng)10 min，隨后加入2 mL正己烷和3 mL水，渦旋混勻，以4 500 r/min離心5 min，提取全部上清溶液，氮氣吹干。加入1 mL甲醇溶液復(fù)溶，進(jìn)行HPLC-MS分析。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

將18種脂肪酸分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸兩類，準(zhǔn)確稱量后配制了兩組混合標(biāo)溶液作為母液，溶液中每種脂肪酸濃度為200 μg/mL。從母液中吸取適量用甲醇稀釋成0.2～100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，存放在4℃冰箱中備用。

1.4 儀器工作條件

(1)色譜條件

色譜柱：XTerra C8(2.1 mm×150 mm，3.5 μm),美國Waters公司；流動相A為水(含5 mmol/L乙酸銨)，B為乙腈(含5 mmol/L乙酸銨)，流速為0.1 mL/min，流動相比例見表1。

(2)質(zhì)譜條件

使用電噴霧電離源(ESI)負(fù)離子模式和多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式分析;噴霧氣(Gasl)、霧化輔助加熱氣(Gas2)、氣簾氣(CUR)和碰撞氣(CAD)均為氮氣;裂解電壓:130 V;干燥氣溫度:350℃;脫溶劑氣流速：9.0 L/min;毛細(xì)管電壓:3.8 kV。

表1 流動相配比

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的建立

脂肪酸分析用的MS-MS多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式應(yīng)盡量減少血漿基質(zhì)干擾。脂肪酸在負(fù)離子模式下，加碰撞能產(chǎn)生的碎片離子靈敏度很低。最大碎片離子為脂肪酸失去羥基水得到的 [M-18]-離子，但這個碎片離子的靈敏度很低，無法滿足定量條件的要求。雖然選擇離子掃描(SIM)模式比MRM模式在脂肪酸的分析中有更好的靈敏度，但是SIM模式會有更多的分析干擾。為了減少血漿基質(zhì)的干擾，同時確保有較好的靈敏度，在分析時仍采用MRM模式，但不加碰撞能，子離子依然選擇母離子碎片離子。

2.2 流動相的選擇優(yōu)化

考察了含有不同比例乙腈-水的多種流動相體系。在純水和乙腈為流動相時，脂肪酸離子化效率較差，質(zhì)譜響應(yīng)很弱。在流動相中添加5 mmol/L乙酸銨后，改變了流動相的pH值，提高了離子化效率，響應(yīng)值增加。實驗以5 mmol/L乙酸銨乙腈-水溶液為流動相，采用梯度洗脫程序，實現(xiàn)了18種脂肪酸良好分離，且峰形良好。

2.3 提取條件優(yōu)化

試驗考察了提取混合液加入量對樣品中脂肪酸提取效果的影響。分別取1 mL血清于15 mL離心管中，加入50 μL同位素十六烷酸內(nèi)標(biāo)溶液(10 mg/L)，分別加入1、3、5、7、9 mL混合液(異丙醇-正己烷-2 mol/L磷酸，體積比40∶10∶1)，在室溫下反應(yīng)10 min，加入2 mL正己烷和3 mL水，渦旋混勻，以4 500 r/min離心5 min，提取全部上清溶液，氮氣吹干。加入1 mL甲醇溶液復(fù)溶，進(jìn)行HPLC-MS分析。

試驗發(fā)現(xiàn)，隨著混合液加入量的增加，樣品提取的回收率也增加，但當(dāng)提取液到5 mL后，樣品回收率增加很少并趨于恒定，所以最終選取加入5 mL混

合液提取樣品。

2.4 色譜柱的選擇

試驗比較了XTerra C8色譜柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm )，XTerra C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm )和BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)在相同的梯度條件下，對標(biāo)準(zhǔn)溶液18種脂肪酸的分離效果。結(jié)果表明，XTerra C8色譜柱對18種脂肪酸的分離效果最好，見圖1。因此選用XTerra C8色譜柱進(jìn)行樣品分析。BEH C18色譜柱是UPLC分離中的通用型色譜柱，但對于脂肪酸這種非水溶性的弱極性化合物，分離度較差；XTerra C8色譜柱比XTerra C18色譜柱極性弱，因此對脂肪酸這種弱極性化合物有更好的分離效果。

圖1 XTerra C8色譜柱液質(zhì)譜圖

2.5 線性方程及檢出限

在0.2～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)，以外標(biāo)物峰面積y對濃度x(μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按S/N=3計算檢出限，S/N=10計算定量限，結(jié)果見表1。由表1可見，18種脂肪酸在測定范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。

表1 18種脂肪酸線性方程及檢出限

2.6 方法回收率及精密度

在1 mL血清中(本底值均為0)加入50 μL同位素十六烷酸內(nèi)標(biāo)溶液(10 mg/L)，用本法提取并測定,以考察方法的回收率。試驗表明,方法的回收率為90.02%～100.05%，結(jié)果見表2。

表2 同位素十六烷酸加標(biāo)回收試驗結(jié)果

為考察方法的精密度，分別平行提取9個血清樣品，每個血清樣品重復(fù)測定3次，結(jié)果列于表3。

表3 血清中脂肪酸含量及實驗精密度

由表3可見，方法精密度在9%以內(nèi)，因此該法可以用于血清樣品中游離脂肪酸的測定。

3 結(jié)語

建立了一種高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定人體血液中脂肪酸含量的方法。該法快速、準(zhǔn)確，具有精密度高、準(zhǔn)確度好、操作簡單等特點，為人類相關(guān)疾病的脂肪酸分析提供了一種可靠、高效的方法。

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