桑詠梅 張桂娟 丁振鐸 黃志剛

(黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院 生物技術(shù)系，哈爾濱 150025)

榛蘑為真菌植物門(mén)真菌蜜環(huán)菌的子實(shí)體，元蘑為側(cè)耳科真菌側(cè)耳的子實(shí)體。榛蘑是我國(guó)一種重要的藥食兩用真菌，由其制成的藥物即使大劑量服用，也不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，是藥品食品工業(yè)共同關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。許多關(guān)于真菌多糖的研究報(bào)道顯示多數(shù)食用真菌多糖都具有抗腫瘤、抗輻射、抗衰老及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，部分多糖已經(jīng)在臨床上普遍用于治療癌癥。

保健野菇片主要以野生榛蘑、元蘑為原料制成片劑。本文對(duì)榛蘑、元蘑混合浸膏中主要有效成分之一的真菌多糖含量測(cè)定方法進(jìn)行探討，為保健野菇片中多糖藥理作用的研究及其新藥開(kāi)發(fā)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器

電子天平、紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)(T6新世紀(jì))、電熱恒溫水浴鍋、低速離心機(jī)。

1.2 試劑

苯酚、濃硫酸、95%乙醇、葡萄糖等，水為純化水，其他試劑為分析純。

1.3 材料

榛蘑、元蘑均購(gòu)自于黑龍江省亞布力山特產(chǎn)品有限公司，經(jīng)專(zhuān)家鑒定為正品，產(chǎn)地為黑龍江省葦河林業(yè)局。

2 方法與結(jié)果

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精確稱(chēng)取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1010g，加純化水溶解后定容至1 000ml容量瓶中，即得濃度為0.1mg·ml-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 樣品溶液的制備

運(yùn)用水提醇沉法提取、干燥，得蘑菇干浸膏，精確稱(chēng)取1～9號(hào)浸膏各一定量，置燒杯中，分別加12倍量純化水加熱溶解，不溶物3 000r·min-1下離心20min離心除去，上清液加4倍量95%乙醇靜置48h，同上條件離心取沉淀，加水溶解，重復(fù)醇沉，靜置24h，離心取沉淀，加純化水溶解定容至10ml，作為供試品溶液。

2.3 測(cè)定方法

分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液2.0ml及供試品溶液2.0ml于具塞比色管中，加5%苯酚溶液1.0ml，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0ml，搖勻，放置5min后，于40℃水浴放置15min，取出迅速冷卻至室溫，于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[2]。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2、4、6、8、10ml于10ml容量瓶中定容，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)得吸光度分別為0.237、0.490、0.782、0.997、1.301。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(見(jiàn)圖1)，得回歸方程為C=0.002+0.076A(r=0.998 9)。線(xiàn)性范圍為0.02～0.10mg·ml-1。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法分別測(cè)定6次，RSD=0.21%(n=6)。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取3號(hào)供試品溶液0.4ml定容至10ml，按“2.3”項(xiàng)下方法每間隔30min測(cè)定一次吸光度，RSD=0.30%(n=6)，結(jié)果表明顯色在3h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

平行取3號(hào)樣品溶液0.2ml于10ml容量瓶中，定容，分別精密量取2.0ml于5支具塞比色管中，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，RSD=2.85%(n=5)，說(shuō)明重現(xiàn)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)

取0.4ml3號(hào)樣品液定容至10ml，分別移取0.8、1.0、1.2、1.4、1.6ml于5支2ml容量瓶中，各加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.1ml，定容至2ml，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，結(jié)果(見(jiàn)表1)。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=5)

2.4.6 樣品含量測(cè)定

分別取1～9號(hào)浸膏，按“2.2”項(xiàng)下方法處理，“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，按回歸方程計(jì)算出溶液中多糖含量。多糖含量(%)=cd/w。式中c為多糖溶液濃度(mg·ml-1)，d為供試品溶液稀釋倍數(shù)，w為樣品重量(mg)。計(jì)算得出9個(gè)樣品中的多糖含量，見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(%)

3 結(jié)論

苯酚—硫酸比色法是測(cè)定多糖含量較為經(jīng)典有效的方法之一，利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，再用比色法測(cè)定，在490nm處有強(qiáng)吸收[3]。本研究根據(jù)浸膏中多糖在490nm波長(zhǎng)處有特征吸收，且吸光值與糖濃度呈線(xiàn)性關(guān)系這一特點(diǎn)，建立了苯酚—硫酸法測(cè)定榛蘑、元蘑混合浸膏總多糖含量的方法，測(cè)得不同實(shí)驗(yàn)方法制得的9種浸膏樣品中總多糖的含量，取得了比較滿(mǎn)意的結(jié)果。本法簡(jiǎn)便，顯色穩(wěn)定，靈敏度高，重現(xiàn)性好。為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為多糖藥理作用的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]孫運(yùn)鳳.食用菌多糖的藥理作用及應(yīng)用前景[J].社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志,2006,4(1):29～31.

[2]李術(shù)釵,史江寧,王松,等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯中多糖的含量測(cè)定[J].貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,32(6):97～99.

[3]周靜,李艷,薛梅,等.酸漿果多糖的提取及含量測(cè)定[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2000,13(3):242.