張路平 任進民

LC-MS/MS法測定人血漿中帕羅西汀及其藥動學

張路平 任進民

帕羅西汀;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;藥動學

1 儀器與試藥

API 4000型液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子化源和Analyst 1.4軟件(美國ABI公司)。Prominence LC-20A液相色譜儀，配有二元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器和柱溫箱(日本島津公司)。

帕羅西汀對照品(中國藥品生物制品檢定所，含量97.4%，批號:100357-200301);維拉帕米對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:0223-9601);鹽酸帕羅西汀片(北京萬生藥業(yè)有限責任公司，規(guī)格20 mg/片，批號090601);甲醇、乙腈為色譜純，甲酸為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件 色譜條件:色譜柱 C 18柱(4.6 mm×50 mm，5 μm);流動相 2 mmol/L 甲酸水溶液(含0.1%甲酸)-乙腈(61∶39);流速 0 .5 ml/min;進樣量 4 0 μl;柱溫 2 0℃。

質(zhì)譜條件:離子源 電噴霧離子化(ESI)源;噴霧電壓5 500 V;霧化溫度550℃;霧化氣40 L/min;簾氣25 L/min;碰撞氣8 L/min;輔助氣45 L/min;檢測方式 正 離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z 330.5→m/z 192.2(帕羅西汀)，m/z 455.5→m/z 165.2(內(nèi)標，維拉帕米)，碰撞誘導(dǎo)解離(CID)電壓均為30 V和45 V;駐留時間均為100 ms。

2.2 溶液配制 對照品貯備液:精密稱取帕羅西汀對照品28.5 mg(相當于帕羅西汀25.0 mg)，置25 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，得1.00 mg/ml的對照品貯備液。

內(nèi)標溶液:精密稱取維拉帕米對照品25.0 mg，置25 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，作為內(nèi)標貯備液。精密吸取維拉帕米儲備液100 ml于10 ml量瓶中，用乙腈稀釋并定容，混勻，再吸取此溶液250 ml于500 ml量瓶中，用乙腈稀釋并定容配成濃度為5.00 ng/ml的內(nèi)標工作液。

2.3 血樣處理 精密吸取血樣100 μl，加入內(nèi)標工作液200 μl(5.0 ng/ml維拉帕米的乙腈溶液)，渦旋 3 0 s，6 000 r/min 離心5 min，精密吸取上清液 1 00 μl，加入水 0 .4 ml，渦旋 3 0 s，取樣測定。

2.4 專屬性試驗 空白血漿、空白血漿加帕羅西汀(20.0 ng/ml)和內(nèi)標 ( 5.0 ng/ml)、志愿者服藥4 h后的血漿樣品色譜圖見圖1。帕羅西汀與內(nèi)標的保留時間分別為1.4和1.5 min，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。低、中、高3個濃度(0.50、4.0、16.0 ng/ml)血樣的基質(zhì)效應(yīng)分別為 1 04%、104% 和100%，RSD(%，n=5)分別為5.8、7.3 和3.7。

圖1 血漿中帕羅西汀的LC-MS/MS色譜圖

2.5 線性試驗 取空白血漿，制成含帕羅西汀200.0、100.0、40.0、15.0、5.00、2.00 ng/ml的系列濃度線性工作液，按照“2.3”項下方法操作后進樣測定。以帕羅西汀與內(nèi)標峰面積之比R為縱坐標，帕羅西汀濃度c為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為 R =0.0675c+0.00344，r=0.9998 。結(jié)果表明，帕羅西汀在0.20～20.0ng/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。定量限為 0 .20 ng/ml。

2.6 精密度與回收率試驗 按照2.3項下方法制備低、中、高3 個濃度(0.50、4.0、16.0 ng/ml)的血漿樣品，各6 份，共4 批，分別進樣測定，計算得日內(nèi)、日間RSD(%，n=6)分別為2.7、2.2、3.8 和 1 1.3、10.8、5.7。方法回收率分別為 9 7.6%、97.5%、97.3%。同 上 制 備 低、中、高 濃 度 ( 0.50、4.0、16.0 ng/ml)的血漿樣品，各6份，分別測定帕羅西汀的峰面積A1與相應(yīng)濃度帕羅西汀溶液的峰面積A2，按A1/A2×100%計算 1 的提取回收率(%)，結(jié)果分別為90.7、93.8 和94.7(n=6)。內(nèi)標的提取回收率為111.7%(n=9)。

2.7 穩(wěn)定性試驗 分別考察濃度為0.50和16.0 ng/ml的帕羅西汀血漿樣品避光室溫放置4 h、樣品處理后室溫放置24 h、凍融3次和凍存40 d的穩(wěn)定性，所得帕羅西汀峰面積的RSD(%，n=3)均小于6.7%，表明血漿樣品在上述條件下均穩(wěn)定。

2.8 血藥濃度測定 18名男性健康志愿者，年齡(21.4±1.5)歲，體重(63±7)kg，試驗前經(jīng)體檢證實心、肝、腎功能和血糖等均正常，試驗前2周及試驗期間未用其他藥物，本試驗方案經(jīng)醫(yī)學倫理委員會審核批準。18名男性健康志愿者單劑量口服帕羅西汀片20 mg，分別于服藥前和服藥后 0.5、1、2、3、4、5、6、8、12、24、36、60、84、120 h 肘靜脈取血 3 ml，置肝素離心管中，混勻后離心(6 000×g)10 min，分離血漿，－70℃保存，依法測定，平均藥-時曲線見圖2。主要藥動學參數(shù)為 Cmax(9.33 ±5.54)ng/ml，tmax(5.28 ±1.56)h，t1/2(19.72 ±8.71)h，AUC0-120 h(221.6 ± 192.9)μg·ml－1· h－1和 AUC 0-∞(230.9 ±202.5)μg·ml－1·h－1。

圖2 18名健康受試者口服帕羅西汀片后的平均藥-時曲線

3 討論

帕羅西汀的體內(nèi)濃度較低，仍可用HPLC-UV法或HPLCMS法測定，但需要液液萃取或者固相萃?。?，2］，血樣預(yù)處理比較繁瑣，耗費時間，難以提高測定的樣本量，因此選擇使用LCMS/MS法。

本試驗采用乙腈直接沉淀蛋白方法，經(jīng)稀釋后直接進樣測定，結(jié)果表明本法專屬性好，靈敏度、重現(xiàn)性均滿足藥動學和血樣檢測分析要求。本法血樣預(yù)處理較文獻［3］簡便易行，兩者靈敏度相似。

1 彭文興，符棘玉，蔣麗麗，等.HPLC-MS法測定血漿中的帕羅西汀及人體內(nèi)藥動學研究.中國藥學雜志，2003，38:868-870.

2 林治光，李華芳，翁毅仁，等.帕羅西汀片在健康志愿者體內(nèi)的生物等效性.中國臨床藥學雜志，2005，14:231-233.

3 Massaroti P，Cassiano NM，Duarte LF，et al.Validation of a Selective Method for Determination of Paroxetine in human plasma by LC-MS/MS.J Pharm Pharmaceut Sci，2005，8:340-347.

R 917

A

1002－7386(2011)15－2357－02

10.3969/j.issn.1002 －7386.2011.15.075

050011 河北省石家莊市中心醫(yī)院(張路平);河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院(任進民)

帕羅西汀(Paroxetine)屬強力、高度選擇性的5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑。其抗抑郁作用和治療強迫性神經(jīng)癥、驚恐障礙及社交焦慮癥的療效被認為與其所具有的特異性抵制腦神經(jīng)的5-HT再攝取有關(guān)。本品的化學結(jié)構(gòu)不同三環(huán)類、四環(huán)類及現(xiàn)有的其他抑郁藥。它對去甲腎上腺素、多巴胺再攝取的影響極小。體外放射性配體結(jié)合試驗表明，本品和毒蕈堿受體、α1、α2、β受體、多巴胺受體幾乎沒有親和性。現(xiàn)有文獻報道的人體內(nèi)帕羅西汀測定方法主要為HPLC法、HPLC-MS法等［1，2］，操作較繁瑣、或者靈敏度較低，應(yīng)用 LC-MS/MS 法較少［3］。本研究參考文獻，以維拉帕米(verapamil)為內(nèi)標，建立了LC-MS/MS法測定人血漿中的帕羅西汀，定量限為0.20 ng/ml，為帕羅西汀的血藥濃度檢測和藥動學的研究提供參考。

2011－03－14)