上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院內(nèi)科(上海 200032）

柔肝瀉脂方對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠 SOD、MDA的影響*

陳瓊項(xiàng)曉覺(jué)毛娜上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院內(nèi)科(上海 200032）

目的:探討柔肝瀉脂方對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠超氧化物歧化酶(SOD）和脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO）的降解產(chǎn)物丙二醛(MDA）的影響。方法:以高脂飲食建立大鼠脂肪肝模型,造模成功后給予中藥“柔肝瀉脂方”干預(yù) 4周后檢測(cè)各組大鼠血清和肝勻漿 SOD、MDA的含量變化。結(jié)果:模型組大鼠血清和肝勻漿中 SOD水平明顯低于正常組,MDA含量明顯高于正常組;通過(guò)給藥治療,與模型組比較,柔肝瀉脂方各組血清及肝勻漿中 SOD水平均明顯增高,MDA含量顯著降低;與血脂康組比較,大鼠肝勻漿 SOD含量升高及 MDA含量降低以柔肝瀉脂方預(yù)防組和大劑量組最為顯著。結(jié)論:柔肝瀉脂方可以顯著提高血清和肝組織的抗氧化能力,抵御肝細(xì)胞的氧應(yīng)激和過(guò)氧化,使肝細(xì)胞免受損傷,達(dá)到預(yù)防和治療脂肪肝的目的。

MDA反應(yīng)除干擾肝內(nèi)脂質(zhì)代謝外,還導(dǎo)致自由基生成增多,使得細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化,肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能損害[1],MDA反應(yīng)的產(chǎn)物除破壞生物膜、蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)外,還可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),激活肝枯否氏細(xì)胞(KupffersCell）和肝星形細(xì)胞(HSC）,引發(fā)纖維化[2]。因此 MDA異常是導(dǎo)致脂肪肝的重要因素之一[3-4],我們通過(guò)高脂飲食建立脂肪肝模型,旨在研究和探討在全國(guó)著名老中醫(yī)姚培發(fā)教授治療脂肪肝經(jīng)驗(yàn)方的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步改進(jìn)而成的“柔肝瀉脂方”對(duì)非酒精性脂肪肝(NAFL）大鼠超氧化物歧化酶(SOD）,脂質(zhì)過(guò)氧化物的降解產(chǎn)物丙二醛(MDA）影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠:45只,雄性,8周齡,體重:215±15g。中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬 ）2003-0003。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.2 藥物 柔肝瀉脂方(何首烏 20g,枸杞子、生地各12g,澤瀉 20g,丹參 30g,生山楂 15g）,按處方比例將各藥材加水煎煮 2次,過(guò)濾 ,合并 ,按人鼠等效劑量換算,濃縮生藥濃度為 1.06g/mL(柔肝瀉脂方小劑量 ）,2.11g/mL(柔肝瀉脂方中劑量）及 4.23g/mL(柔肝瀉脂方大劑量）備用。血脂康膠囊 (國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào) Z10950029,批號(hào) 20030925）,成人日服 1.2g,按人鼠等效劑量換算,研磨后用滅菌蒸餾水稀釋濃度為 0.01g/mL。

1.3 試劑 TG:寧波博泰生物技術(shù)有限公司 (批號(hào)041014）;CHOL:寧波博泰生物技術(shù)有限公司(批號(hào) 050302）。

1.4 飼料 正常組給予普通顆粒飼料,其它各組 1～ 6周給予高脂飼料。高脂飼料配方如下:10%豬油,1%膽固醇,5%蔗糖,0.5%膽鹽,0.2%丙硫氧嘧啶,83.3%基礎(chǔ)飼料。

2 方法 2.1 分組 45只大鼠自由飲水進(jìn)食適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周后,隨機(jī)分為 6組,正常對(duì)照組 5只,模型組、柔肝瀉脂方小劑量組、柔肝瀉脂方中劑量組、柔肝瀉脂方大劑量組、血脂康組各 8只。

2.2 飼料及給藥 正常組 1～ 10周給予正常飼料,其余各組 1～ 6周給予高脂飼料,7～ 10周改為正常飼料。正常組及模型組從第 7周起給予蒸餾水 10mL/kg灌胃直至第 10周末。余下各組從第 7周起分別給予不同劑量的柔肝瀉脂方或血脂康灌胃,直至第 10周末。

2.3 取材 第 10周末,于最后 1次給藥后禁食 12h,2%戊巴比妥納 40mg/kg腹腔注射麻醉,腹主動(dòng)脈取血,一部分室溫放置 30min,離心取上清待測(cè)血脂、SOD、MDA等指標(biāo),迅速剖取肝臟,冰生理鹽水洗滌 ,濾紙拭干后稱(chēng)量肝重,于肝右葉距邊緣 0.5cm取兩塊 1cm3裝入 eppdorf管,-70℃保存待做肝組織勻漿。

2.4 觀測(cè)指標(biāo) 血清、肝勻漿 SOD的測(cè)定:按試劑盒說(shuō)明操作;血清、肝勻漿 MDA的測(cè)定:按試劑盒說(shuō)明操作。

3 結(jié) 果 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組大鼠均無(wú)死亡,各組大鼠體重緩慢持續(xù)增長(zhǎng),活動(dòng)靈敏,組間未見(jiàn)明顯差異。各組大鼠血清、肝勻漿 SOD、MDA的變化如下表所示:

3.1 各組大鼠血清 SOD,MDA的變化 見(jiàn)表 1。

表1 各組大鼠血清 SOD,MDA的變化 (±s）

表1 各組大鼠血清 SOD,MDA的變化 (±s）

注:與模型組相比較,△P＜0.05,▲P＜0.01;柔肝瀉脂方各組與血脂康組比較,◇P＜0.05,◆P＜0.01。

組 別 n SOD(NMOL/ML） MDA(NU/ML）正常組 5 196.038±3.708▲ 2.265±0.201▲模型組 8 140.013± 5.800 3.859± 0.430預(yù)防組 8 190.307±3.452▲◇ 2.848±0.347▲小劑量組 8 154.736±8.448△ 3.030±0.700中劑量組 8 160.961±6.559▲ 2.550±0.322▲大劑量組 8 195.643±4.511▲◆ 2.285±0.352▲血脂康組 8 170.644±10.601▲ 2.517±0.317▲

圖1 正常組×100倍大鼠肝細(xì)胞未見(jiàn)脂肪變性

圖2 模型組×100倍大鼠肝細(xì)胞發(fā)生顯著脂肪變性

從表 1可知,模型組大鼠血清 SOD含量明顯低于正常組,MDA明顯高于正常組,差異均有顯著性意義 (P＜0.01）。藥物干預(yù)后,與模型組比較:柔肝瀉脂方各組及血脂康組 SOD含量均顯著增高(P＜0.05,P＜0.01）;MDA含量均顯著降低 P＜0.01(除柔肝瀉脂方小劑量組）。

柔肝瀉脂方各組與血脂康組比較:柔肝瀉脂方預(yù)防組、大劑量組血清 SOD含量顯著升高(P＜0.05,P＜0.01）;MDA含量無(wú)明顯差異(P＞0.05）。

3.2 各組大鼠肝勻漿 SOD,MDA的含量變化 見(jiàn)表 2。

表2 各組大鼠肝勻漿 SOD,MDA的變化(±s）

表2 各組大鼠肝勻漿 SOD,MDA的變化(±s）

注:與模型組相比較,△P＜0.05,▲P＜0.01;柔肝瀉脂方各組與血脂康組比較,◇P＜0.05,◆P＜0.01。

組 別 n SOD(NMOL/ML） MDA(NU/ML）正常組 5 54.279±4.936▲ 0.193±0.024▲模型組 8 45.575±1.549 0.288±0.034預(yù)防組 8 53.134± 0.913▲◆ 0.203± 0.029▲◆小劑量組 85 1.116± 1.705▲ 0.214± 0.026▲◇中劑量組 8 51.023±1.391▲ 0.224± 0.035▲◇大劑量組 8 55.416± 0.727▲◆ 0.188± 0.032▲◆血脂康組 8 50.410±1.466▲ 0.261±0.057

從表 1可知:模型組大鼠肝勻漿 SOD含量明顯低于正常組,MDA含量明顯高于正常組,差異均有顯著性意義(P＜0.01）。藥物干預(yù)后,與模型組比較:柔肝瀉脂方各組 SOD含量均顯著增高(P＜0.01）,MDA含量均顯著降低(P＜0.01）;血脂康組 SOD含量顯著增高 (P＜0.01）,MDA含量有降低趨勢(shì),但尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。柔肝瀉脂方各組與血脂康組比較:SOD含量預(yù)防組和大劑量組升高顯著(P＜0.01）,MDA含量各組均顯著降低(P＜0.05,P＜0.01）。

3.3 肝組織病理變化 HE染色觀察 正常組大鼠肝細(xì)胞未見(jiàn)脂肪變性(見(jiàn)圖 1）,模型組大鼠肝細(xì)胞發(fā)生顯著脂肪變性(見(jiàn)圖 2）,治療組肝細(xì)胞脂肪變程度明顯較輕(見(jiàn)圖 3）,對(duì)照組肝細(xì)胞脂肪變程度好于模型組 (見(jiàn)圖 4）。

圖3 治療組×100倍肝細(xì)胞脂肪變程度明顯較輕

圖4 對(duì)照組×100倍肝細(xì)胞脂肪變程度好于模型組

4 討 論(SOD）是超氧離子自由基的專(zhuān)一特效金屬歧化酶,通過(guò)清除自由基,起到保護(hù)機(jī)體的作用,對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。機(jī)體通過(guò)酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基,氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸,引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用,形成脂質(zhì)過(guò)氧化酶 MDA,MDA的含量反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度,間接反應(yīng)出肝細(xì)胞受損程度。各種原因?qū)е碌母闻K脂肪沉積,肝細(xì)胞脂肪變性,主要是因?yàn)榇罅窟€原型輔酶 1(NADH）作用的結(jié)果,NADH濃度增高抑制脂肪酸的β氧化 ,使細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸增加,游離脂肪酸濃度增加可促進(jìn)氧化物酶體的 β氧化,產(chǎn)生大量高度活性的自由基,自由基使脂質(zhì)過(guò)氧化,脂質(zhì)過(guò)氧化后產(chǎn)生 MDA增加,MDA增加使細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑 SOD消耗增加,含量顯著性下降。這一點(diǎn)通過(guò)本實(shí)驗(yàn)中也得以證實(shí):模型組大鼠血清和肝勻漿中 SOD水平明顯低于正常組,MDA含量明顯高于正常組。通過(guò)藥物干預(yù)后,與模型組比較,柔肝瀉脂方各組血清及肝勻漿中 SOD水平均明顯增高,各組血清中 MDA含量顯著降低。與血脂康組比較:柔肝瀉脂方預(yù)防組和大劑量組大鼠肝勻漿 SOD含量升高及MDA含量降低最為顯著。說(shuō)明脂肪肝肝內(nèi)脂質(zhì)沉積,引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),導(dǎo)致抗氧化能力下降,自由基生成增多,而自由基可通過(guò)氧化細(xì)胞膜的脂質(zhì)導(dǎo)致肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的變化,因此脂質(zhì)沉積的增多加重了脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),而脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)可干擾肝內(nèi)脂類(lèi)代謝。藥物干預(yù)后顯示,柔肝瀉脂方可以顯著提高血清和肝組織的抗氧化能力,抵御肝細(xì)胞的氧應(yīng)激和過(guò)氧化,使肝細(xì)胞免受損傷,達(dá)到治療脂肪肝的目的,這也是柔肝瀉脂方治療脂肪肝的機(jī)制之一。柔肝瀉脂方由何首烏、枸杞子、生地、虎杖、菝葜等組成,藥理學(xué)研究表明,何首烏能從膽固醇的吸收、代謝等多途徑防治高脂血癥及動(dòng)脈硬化癥,降低血液的高凝狀態(tài),并能降低組織中 MDA含量,提高機(jī)體組織細(xì)胞SOD的活性以及減少氧自由基對(duì)組織細(xì)胞的損害[5]。枸杞能提高肝組織中超氧化物酶 SOD的活性,維持機(jī)體氧化及抗氧化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡,從而使組織的細(xì)胞免受自由基的侵害[6],此外枸杞多糖對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化還有明顯的預(yù)防和治療作用,可能與其抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、提高 HDL-C/Tch有關(guān)[7]。菝葜具有活血化瘀的藥理作用,表現(xiàn)在抑制血小板聚集和延長(zhǎng)內(nèi)源性凝血時(shí)間,并同時(shí)伴有對(duì)纖維蛋白原生成的影響,對(duì)血小板的數(shù)目沒(méi)有明顯影響[8-9]。并有報(bào)道表明復(fù)方菝葜有增加荷瘤鼠血清中SOD活力,降低 MDA含量的作用[10]?；⒄戎械陌邹继J醇是一個(gè)自由基清除劑 ,虎杖還具有改善微循環(huán),抑制白細(xì)胞,血小板與內(nèi)皮細(xì)胞黏附的作用。由此可推測(cè),柔肝瀉脂方可能通過(guò)清除自由基,抗氧化,調(diào)節(jié)膽固醇的吸收代謝等多途徑來(lái)治療和干預(yù)脂肪肝,達(dá)到治愈脂肪肝目的。

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柔肝瀉脂方 /藥效學(xué) 大鼠 實(shí)驗(yàn)研發(fā)

R57

A

1000-7369(2011）01-0103-03

*上海市教委課題(編號(hào) 02ck01）

(收稿 2010-08-15;修回 2010-09-20）