陳 兵 原 韜

(1.雞西大學(xué) 安全與環(huán)境工程系，黑龍江 雞西 158100；2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150001；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150001)

我國東北地區(qū)的冬季，酸菜基本上是家家戶戶不可缺少的食品，剩余的酸菜發(fā)酵液基本上都廢棄倒掉。隨著對日常健康保健重視的不斷提高，人們已經(jīng)清楚食品中的防腐劑在發(fā)揮作用的同時也帶來了很嚴(yán)重的副作用，特別是化學(xué)防腐劑的副作用更加凸顯。因此尋求一種高效抑菌并低毒的綠色天然防腐劑是21世紀(jì)生物技術(shù)行業(yè)的一項(xiàng)任務(wù)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的這類防腐劑主要以乳酸鏈球菌素為主，是一種多肽類化合物，具備高效綠色防腐的功效，是乳酸菌代謝產(chǎn)生的一種細(xì)菌素，能抑制引起食物腐敗變質(zhì)的微生物和一些致病微生物的生長。目前已有將其作為食品防腐劑的相關(guān)報(bào)道[1]。結(jié)合廢物再加工的環(huán)保理念，可以從具備乳酸菌代謝條件的體系中來提純?nèi)樗徭溓蚓?。酸菜水這種基質(zhì)體系完全符合上述條件，乳酸菌把白菜中糖類代謝分解成乳酸的過程[2]，菌體自身便積累細(xì)菌素產(chǎn)物。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

酸菜水(酸菜發(fā)酵液)，主要從當(dāng)?shù)厮岵耸称芳庸S獲得；

檢測培養(yǎng)基：酵母膏，蛋白胨，蔗糖，氯化鈉，磷酸氫二鈉(12個結(jié)晶水)，pH7.0；

抑菌試驗(yàn)指示菌種：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，由雞西大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；

CM Sephadex C-25凝膠；

標(biāo)準(zhǔn)Nisin樣品，Sigma公司；

標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白系列Mark；

鹽析用硫酸銨；

截留分子量1500單位透析袋；

尿素，SDS-PAGE 。

1.2 儀器設(shè)備

垂直板電泳儀及配套電泳槽；

紫外線分光光度計(jì)；

桌面式超凈工作臺；

層析柱；

真空旋轉(zhuǎn)水浴蒸發(fā)儀；

牛津杯。

2 實(shí)驗(yàn)方法步驟

2.1 酸菜液預(yù)操作

取500ml酸菜水，常溫4 000～5 000r/min離心處理20min，棄除下層雜質(zhì)和菌體泥狀混合物，提取上清液。將上清液用抽真空水浴式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃減壓濃縮10倍。

2.2 鹽析收集抑菌活性物質(zhì)

向50ml濃縮液緩緩加入30%硫酸銨，時時攪拌。沉淀完全后于4℃靜止放置4h。4℃15 000r/min離心處理15min。分別標(biāo)記離心管。取每管上清液和沉淀分別采用牛津杯水平瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，同時用30%硫酸銨溶液做空白。測定上清液和沉淀的抑菌圈直徑。

圖1 30%(NH4)2SO4鹽析后抑菌圈測定

表130% (NH4)2SO4鹽析抑菌圈測定

將抑菌效果不明顯的標(biāo)記離心管中的上清液于4℃緩緩加入60%硫酸銨，時時攪拌。于4℃靜止放置并過夜，4℃15 000r/min離心處理15min，同上步操作進(jìn)行抑菌和對照實(shí)驗(yàn)。

圖2 60%(NH4)2SO4鹽析后抑菌圈測定

表260%(NH4)2SO4鹽析抑菌圈測定

取兩次鹽析抑菌效果最佳的離心管中的沉淀備用。

2.3 除去備用沉淀樣品中硫酸銨鹽

將備用樣品加入截留相對分子質(zhì)量1 500左右的透析袋內(nèi)，蒸餾水作透析外液，4℃下透析，同時用氯化鋇檢測透析袋內(nèi)沒有硫酸鋇產(chǎn)生為止。將透析袋內(nèi)樣品作下一步實(shí)驗(yàn)備用。

2.4 層析分離抑菌活性物質(zhì)

將CM Sephadex C-25凝膠經(jīng)過加熱、洗滌、蒸煮、活化等預(yù)處理后裝入層析柱，固定好后檢查凝膠應(yīng)為均勻堆積無局部裂縫狀態(tài)。采用醋酸—醋酸鈉(HAc-NaAc)作為洗緩沖脫液，將透析后樣品上樣后，人工方式用層析管接收洗脫液，標(biāo)準(zhǔn)為1ml/管，并做好標(biāo)記。洗脫液使用順序是先25ml醋酸緩沖液，再40ml KCl(0.02mol/L)。

收集完畢后在280nm下用紫外分光光度計(jì)測定各管的紫外吸光值，混合吸光值較大的層析管內(nèi)液體組分(即收集65號至80號管內(nèi)液體)。

2.5 干燥制備成品

將上述吸光值大的組分混合進(jìn)行冷凍干燥，得到成品干粉。

2.6 凍干粉抑菌活性檢驗(yàn)

將干粉樣品用0.01mol/L稀鹽酸溶解后稀釋成1mg/ml，以枯草芽孢桿菌為指示菌進(jìn)行抑菌活性檢測。并與標(biāo)準(zhǔn)Nisin進(jìn)行對比抑菌圈[3]。

圖4 抑菌活性檢測對比

2.7 凍干粉相對分子量測定

使用垂直板電泳儀，結(jié)合Urea—SDS—PAGE凝膠電泳法測定分子量[4]。

圖5 電泳圖譜帶

3 結(jié)論

經(jīng)過電泳分析后，樣品出現(xiàn)兩條明顯譜帶，分子量分別為3 500Da和22 000Da左右。即圖5中黑框所指示譜帶。與Nisin相似[5]，具備蛋白質(zhì)性質(zhì)且分子量較小，屬于肽類物質(zhì)，有抑菌活性。可以規(guī)模提純酸菜水中的抑菌活性物，或者分離純培養(yǎng)產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的菌株，來生產(chǎn)綠色天然防腐抑菌產(chǎn)品，有望大規(guī)模投向食品工業(yè)，彌補(bǔ)市場空白與不足。

[1]Hurst A.Nisin and other inhibitory substances from acid bacteria[A].In:A Branen,P N Davidson 320～353.

[2]葛菁萍，鄒鵬，宋剛,等.酸菜發(fā)酵液中乳酸菌的分離與鑒定[J].食品工業(yè)科技，2007,28(10):83～84.

[3]李秀涼，雷宏，孟博，等.肽類抑菌物質(zhì)效價測定[J].食品科技，2006,(2)：113～116.

[4]遲玉杰，王麗秋，高學(xué)軍，等.用尿素—SDS—PAGE凝膠電泳測定乳鏈菌肽分子量[J].中國乳品工業(yè)，1998,(2)：12～13.

[5]陶勇.Nisin及其在食品防腐方面的應(yīng)用[J].食品科技，2008,(2):53～57.