曹 焱 戴偉男 戴鳳海

(1.黑龍江林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱 150081；2.黑龍江省林木種苗管理總站，哈爾濱 150090)

紅松(Pinuskoraiensis)合子胚愈傷組織誘導(dǎo)是紅松離體再生研究的前期準(zhǔn)備，也是通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑進(jìn)行植株再生的重要基礎(chǔ)。筆者經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)，誘導(dǎo)出形態(tài)各異的紅松愈傷組織，可旺盛增殖，但絕大多數(shù)最終不能分化出具有胚性感受態(tài)的細(xì)胞組織，因此有效愈傷組織的增殖與更新則成為針葉樹(shù)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。根據(jù)Arm strong標(biāo)準(zhǔn)將得到的愈傷組織分為3類(lèi)：I型，結(jié)構(gòu)致密、復(fù)雜多樣、生長(zhǎng)緩慢，通過(guò)器官發(fā)生途徑分化芽和根，產(chǎn)生胚狀體較少，不易長(zhǎng)期繼代；Ⅱ型，結(jié)構(gòu)松散、易碎、呈顆粒狀、生長(zhǎng)較快，長(zhǎng)期繼代仍有胚性，能通過(guò)胚狀體途徑再生；Ⅲ型，結(jié)構(gòu)粘軟、水浸狀、白色透明或半透明，容易繼代培養(yǎng)，但幾乎喪失分化能力，為非胚性愈傷組織[2]。試驗(yàn)中，我們根據(jù)Arm strongⅡ型愈傷組織的標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)辨識(shí)哪些是有效愈傷組織，并對(duì)此進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1 材料和方法

1.1 材料

取紅松成熟種子，采種地點(diǎn)為黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)小嶺林場(chǎng)。紅松人工林樹(shù)齡30a左右，現(xiàn)已結(jié)實(shí)7a。采種后置于4℃冰箱低溫保存4周后進(jìn)行接種。

1.2 方法

1.2.1 接種前材料處理

接種完整外植體前，將滅菌后的合子胚分別放置于蔗糖溶液(10、20、30、50、70g·L-1)、PEG 6000(50、70、100、200、450 g·L-1)、甘露醇水溶液(0.5、1、2、4、8mmol·L-1)浸泡處理24h后接種。比較不同處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

1.2.2 培養(yǎng)基中不同蔗糖濃度處理

其他條件不變，取愈傷組織小塊置于蔗糖濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%的培養(yǎng)基中。觀察不同蔗糖濃度對(duì)愈傷組織增殖的影響。

1.2.3 添加ABA、PEG、甘露醇處理

在紅松愈傷組織增殖培養(yǎng)階段，研究ABA、PEG 6000和甘露醇對(duì)愈傷組織及有效愈傷組織增殖的影響。分別添加1、3、5、10、25g·L-1ABA；10、15、20、40、70 g·L-1PEG 6000；0.5、1、2、5、10g·L-1甘露醇。

所有處理均設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)培養(yǎng)皿3～10個(gè)外植體，室溫23～25℃，濕度大于60%。暗培養(yǎng)。4～6周繼代一次。

1.2.4 數(shù)據(jù)獲得及統(tǒng)計(jì)分析方法

試驗(yàn)中獲得的各種愈傷組織均用解剖鏡觀察外部形態(tài)，并記錄、拍照。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 和SPSS軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種前處理對(duì)紅松愈傷組織誘導(dǎo)的影響

接種之前，將滅菌后的完整胚分別置于各濃度的甘露醇溶液(M)、PEG 6000溶液(PEG)和蔗糖溶液(Su)中，浸泡24h后，取出外植體均接種于LM基本培養(yǎng)基添加2mg·L-12,4-D、0.5mg·L-16-BA、0.5mg·L-1TDZ。起初的2周內(nèi)外植體無(wú)愈傷組織產(chǎn)生，整個(gè)外植體變白并膨大，15d后逐漸產(chǎn)生愈傷組織，形態(tài)多為疏松水漬狀，無(wú)色透明或半透明。45d愈傷大量分化，在沒(méi)更換培養(yǎng)基的情況下，60d仍能保持鮮活的狀態(tài)，褐化率極低。據(jù)此推斷，經(jīng)過(guò)甘露醇、PEG 6000和蔗糖溶液處理的合子胚，其表面或內(nèi)部細(xì)胞在外部物質(zhì)的刺激下排列上發(fā)生變化，可以使得外植體幾乎處在同一時(shí)間脫分化，并在很大程度上減少了褐化率，放慢了褐化速度。后期培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，甘露醇處理好于PEG 6000和蔗糖溶液處理。綜合得出：對(duì)外植體進(jìn)行甘露醇、PEG 6000和蔗糖溶液浸泡處理，均可以明顯提高愈傷組織的初始分化率和誘導(dǎo)量，并可以相對(duì)長(zhǎng)時(shí)期保持愈傷組織的旺盛分化能力。

2.2 培養(yǎng)基中不同蔗糖濃度對(duì)紅松愈傷組織增殖的影響

蔗糖濃度不只對(duì)細(xì)胞增殖起作用，同時(shí)也是影響細(xì)胞分化的因素之一。將產(chǎn)生的紅松愈傷組織分小塊(直徑0.5～1cm)接種于添加0.5mg·L-12,4-D、0.2mg·L-16-BA的LM培養(yǎng)基中，分為1%、2%、3%、4%、5%的蔗糖濃度，以蔗糖濃度為3%的處理作為對(duì)照，繼代30d左右觀察增殖效果，試驗(yàn)結(jié)果如圖1。不同蔗糖濃度對(duì)有效愈傷組織的增殖和保持能力不同，但差異不顯著(p<0.05)，說(shuō)明蔗糖濃度對(duì)有效愈傷的增殖率影響不大。從增殖出的有效愈傷組織的外部形態(tài)來(lái)看：蔗糖濃度3%的處理產(chǎn)生的愈傷組織為淺黃色疏松、鮮活狀，有的還產(chǎn)生瘤狀小凸起，分化比較旺盛；蔗糖濃度在1%、2%時(shí)，表面產(chǎn)生細(xì)胞顆?；蚪q毛狀細(xì)胞，這是營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)較差、碳源供應(yīng)不足的表現(xiàn)；蔗糖濃度在4%時(shí)增殖率偏低，原有愈傷組織轉(zhuǎn)變?yōu)閳F(tuán)塊狀并且開(kāi)始干燥，表明此種滲透壓過(guò)大，培養(yǎng)物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較為困難；蔗糖濃度在5%時(shí)，原愈傷組織褐化后重新分化出具有鮮活特性的有效愈傷組織，這表明在愈傷組織受到高滲透壓脅迫時(shí)，褐化的愈傷組織內(nèi)部聚集了一定的活性物質(zhì)，通過(guò)能量的轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生新的有效愈傷組織，但這種變化發(fā)生的頻率較低。高滲透壓下外植體新陳代謝加快，導(dǎo)致大部分的愈傷組織褐化死亡。綜合看來(lái)，蔗糖濃度為3%的培養(yǎng)基對(duì)有效愈傷的增殖比較穩(wěn)定。

2.3 培養(yǎng)基中添加ABA、PEG和甘露醇對(duì)紅松有效愈傷組織增殖的影響

ABA、PEG 6000和甘露醇被認(rèn)為具有促進(jìn)胚性愈傷組織誘導(dǎo)和增殖的作用，可以延緩甚至減少外植體所受脅迫的危害。以LM為基本培養(yǎng)基，不添加其他激素，將誘導(dǎo)出的愈傷組織分別繼代于添加1、3、5、10、25 g·L-1ABA，10、15、20、40、70g·L-1PEG 6000，0.5、1、2、5、10g·L-1甘露醇的各處理中，空白LM培養(yǎng)基作為對(duì)照，繼代30d后觀察增殖效果。

對(duì)照的有效愈傷增殖率為6.5%±4.2%。圖2～圖4分別顯示了添加不同活性物質(zhì)后對(duì)有效愈傷組織增殖的作用效果。從圖中可明顯看到，添加了5g·L-1ABA的處理與對(duì)照及其他處理差異極顯著(p<0.01)，有效愈傷增殖率也為所有處理中最高，這表明5g·L-1ABA為較適宜的濃度。PEG 6000在10、15g·L-1時(shí)與對(duì)照差異顯著(p<0.05)，有效愈傷增殖率達(dá)到25%～26%，隨著PEG 6000濃度逐漸升高，有效愈傷組織增殖率急速下降，這表明PEG 6000濃度偏大，不適宜有效愈傷的誘導(dǎo)增殖，建議選在PEG 6000濃度為10～15g·L-1時(shí)增殖效果較好。甘露醇在0.5g·L-1時(shí)有效愈傷增殖率為顯著水平(p<0.05)，隨著濃度逐漸升高，先是急速下降，而后緩步上升，并趨近平穩(wěn)，這表明應(yīng)加入低濃度的甘露醇促進(jìn)有效愈傷的增殖。

3 討論

3.1 接種前處理與有效愈傷組織的誘導(dǎo)

本試驗(yàn)中經(jīng)過(guò)蔗糖溶液、PEG 6000和甘露醇浸泡處理24 h的合子胚，在誘導(dǎo)過(guò)程中顯示出了不易褐化并且旺盛分化的效果。試驗(yàn)中三種處理的外植體誘導(dǎo)率都達(dá)到了相當(dāng)高的水平，說(shuō)明經(jīng)過(guò)處理的外植體其表面或內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，對(duì)外界的刺激變得敏感，有利于愈傷組織的誘導(dǎo)。但到繼代培養(yǎng)的后期，愈傷組織雖增殖迅速，卻未見(jiàn)胚狀體的發(fā)生，因此對(duì)其是否能促進(jìn)胚性愈傷組織的發(fā)生還需繼續(xù)探索。

3.2 蔗糖濃度與有效愈傷組織的增殖

在植物組織培養(yǎng)中蔗糖能支持大多數(shù)離體培養(yǎng)物的旺盛的生長(zhǎng)，以至大多數(shù)合成培養(yǎng)基均以蔗糖作為唯一的碳源。因此，蔗糖的用量不僅影響培養(yǎng)物生長(zhǎng)的速度和生長(zhǎng)量，而且影響其代謝水平，次生代謝物的合成以及細(xì)胞形態(tài)和發(fā)生，是影響植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵[3]。本研究表明，當(dāng)蔗糖濃度為2%時(shí)，有效愈傷組織誘導(dǎo)率最高，但有效愈傷組織不容易保持，容易在表面產(chǎn)生絨毛狀細(xì)胞；當(dāng)蔗糖濃度高達(dá)5%時(shí)，在一定的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)有效愈傷組織迅速增加，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素耗費(fèi)加速，外植體新陳代謝加快，從而導(dǎo)致培養(yǎng)物迅速褐化；而當(dāng)蔗糖濃度在3%時(shí)，有效培養(yǎng)物可保持較長(zhǎng)時(shí)間，并不斷分化。由此可見(jiàn)，蔗糖濃度對(duì)提高有效愈傷組織的誘導(dǎo)頻率以及形成高質(zhì)量的培養(yǎng)物尤為關(guān)鍵。

3.3 ABA、PEG和甘露醇與有效愈傷組織的增殖

本試驗(yàn)中，添加了5g·L-1ABA的增殖培養(yǎng)基產(chǎn)生的有效愈傷達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明ABA可以促進(jìn)有效愈傷組織的產(chǎn)生。PEG在10～15g·L-1的范圍也與其他濃度的誘導(dǎo)率達(dá)到顯著水平。之前曾說(shuō)PEG有促進(jìn)愈傷組織分化、刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)等優(yōu)點(diǎn)，本試驗(yàn)的結(jié)果驗(yàn)證了這一理論。甘露醇只在0.5g·L-1的水平下，有效愈傷增殖達(dá)到了顯著水平。這表明，在愈傷組織的增殖培養(yǎng)中，添加適當(dāng)濃度的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞勢(shì)、滲透壓等的物質(zhì)可提高愈傷組織的增殖率。

4 結(jié)論

接種紅松成熟合子胚之前，用蔗糖、PEG、甘露醇等高滲透壓的物質(zhì)浸泡種子更有利于愈傷組織的誘導(dǎo)以及使產(chǎn)生的愈傷組織活性延長(zhǎng)。紅松有效愈傷組織增殖階段，蔗糖濃度與一般樹(shù)種對(duì)碳水化合物的需求基本相同，最佳為3%；在培養(yǎng)基中加入適量的高滲透壓物質(zhì)，可以促進(jìn)紅松有效愈傷組織的增殖。

[1]王偉達(dá),李成浩,楊靜莉,張含國(guó).不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)雜種落葉松胚性愈傷組織增殖的影響[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008,(9):5～7.

[2]曹昆,李霞.木本植物組織培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)研究[J].江蘇林業(yè)科技，2008,(10):43～48.

[3]Flowler MW, Wastson Rlyons. In Proc.5th Ind. Cong[M].Plant Tissue and Cell Culture,1982：225～228.