孫光明，朱桂芳，常月琴

(江蘇大學附屬第四人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

一株銅綠假單胞菌新型整合子檢測與分析

孫光明，朱桂芳，常月琴

(江蘇大學附屬第四人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

目的了解臨床分離銅綠假單胞菌PA 091701整合子攜帶耐藥基因情況，探討新的基因盒排列與多重耐藥關系。方法藥物敏感試驗采用K-B紙片擴散方法，整合子及耐藥基因盒的檢測采用PCR方法。結(jié)果在所測試抗菌藥物中，PA091701表現(xiàn)對多粘菌素敏感，對亞胺培南和哌拉西林/他唑巴坦中介，對其它種類抗菌藥物耐藥；基因盒檢測結(jié)果顯示，PA091701所攜帶aac(6’)II、aadA13和oxA10a基因盒為首次出現(xiàn)新的基因盒排列方式，并已登錄Gen Bank：JN118546。結(jié)論PA091701攜帶的基因盒與其對氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類耐藥有關，表明其多重耐藥性除整合子外，還存在其它耐藥機制。

銅綠假單胞菌；整合子；耐藥

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa PA)是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌。由于抗菌藥物的廣泛使用，PA的耐藥性逐漸增加，導致臨床抗感染治療的失敗。PA耐藥機制包括菌體固有耐藥機制和獲得性耐藥機制。近年來研究結(jié)果表明，通過耐藥基因水平轉(zhuǎn)移而獲取外界耐藥基因是引起PA迅速形成耐藥的主要原因，而整合子被認為與這一形成過程密切相關[1，2]。整合子是一耐藥基因捕獲并表達元件，目前已經(jīng)出現(xiàn)4種耐藥相關整合子類型，其中I類整合子分布最為廣泛，與臨床耐藥關系也最為密切[3]。本研究通過對本地區(qū)PA的整合子進行檢測，發(fā)現(xiàn)I類整合子新的耐藥基因盒排列形式，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

菌株PA091701來自我院ICU病房一住院病人呼吸道感染患者痰標本，菌株的鑒定采用法國梅里埃公司API板條。

1.2 藥物敏感試驗

藥物敏感試驗采用K-B紙片法，結(jié)果判讀參照2009年CLSI標準，測試藥物包括哌拉西林、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、左氧氟沙星、多粘菌素。藥敏紙片均購自美國BD公司。質(zhì)控菌株采用大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.3 I類整合子及整合子可變區(qū)PCR檢測

細菌模板提取采用煮沸方法。整合子及可變區(qū)基因引物設計參照已知文獻[4]，引物由英駿公司合成。intI1上游引物 5′-ACATGTGATGGCGACGCACGA-3′，下游引物 5′-ATTTCTGTCCTGGCTGGC-3′；整合子可變區(qū)上游引物 5′-GGCATCCAAGCAGCAAG-3′， 下 游 引 物 5′-AAGCAGACTTGACCTGA-3′。I類整合子基因檢測PCR反應 體 系 設 50μl， 其 中 10 ×PCR Buffer 5.0μl，dNTP4.0μl，引物各 1μl，模板 2μl，Taq 酶 1μl，加蒸餾水至50μl。擴增條件為94℃預變性5min，94℃變性30s，50℃退火 30s，72℃延伸 1min，反應 30個循環(huán)，最后72℃延伸7min。整合子可變區(qū)擴增采用長鏈高保真 PCR(大連寶生)，反應體系 50μl，其中 10×PCR Buffer 5.0μl，dNTP 4.0μl， 引 物 各 1μl，酶0.25μl。反應參數(shù)為：94℃預變性 5min，94℃變性1min，55℃退火 1min，72℃延伸 4min，反應 35個循環(huán)，最后72℃延伸7min。

1.4 PCR產(chǎn)物純化、克隆及測序

純化后的PCR產(chǎn)物連接PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至CaCl2制備的大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)氨芐西林(100mg/L)的LB培養(yǎng)基進行藍白斑篩選，挑選白色菌落涂布平板，菌落PCR篩選陽性克隆，陽性克隆菌株提取質(zhì)粒送上海英駿公司進行雙向測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

測序拼接結(jié)果在Gen Bank進行比對分析，確定整合子類型，并詳細分析整合子可變區(qū)詳細基因序列。

2 結(jié)果

2.1 銅綠假單胞菌耐藥表型分析

PA091701菌株藥敏結(jié)果僅顯示對多粘菌素敏感，對亞胺培南和哌拉西林/他唑巴坦中介，對其它測試藥物均耐藥。

2.2 整合子及可變區(qū)基因檢測分析

PA091701采用I類整合子檢測結(jié)果顯示其攜帶I類整合子基因(圖1)，為了方便有效的擴增并測序可變區(qū)的基因序列，采用長鏈高保真PCR，結(jié)果顯示約3000bp出現(xiàn)一陽性條帶(圖2)，經(jīng)克隆測序的序列結(jié)果比對分析，基因盒排列為aac(6’)II、aadA13、oxA10a，為一新的耐藥基因盒排列形式。該基因序列已登錄Gen Bank，基因號：JN118546。

3 討論

近年來隨著侵入診治技術的不斷增多，免疫抑制劑及廣譜抗生素的廣泛使用，非發(fā)酵菌屬PA分離率有明顯增高趨勢，與此同時，該菌的耐藥率也不斷攀升[5]。本實驗所報道的PA菌株為一臨床高度耐藥菌株，僅表現(xiàn)了對多粘菌素的敏感，對其它種類抗生素包括碳青霉烯類耐藥或中介，應引起我院足夠重視。

圖1 I類整合子PCR擴檢測結(jié)果圖：M為DNA2000maker，從上到下 2000、1500、1000、750、500、250；1、2、3、4、5 為 I類整合子基因擴增陽性標本。

圖2 I類整合子可變區(qū)PCR擴檢測結(jié)果圖：M為DNA10000maker，圖中亮帶從上到下分別顯示顯示6000、3000和1000bp條帶；1為I類整合子可變區(qū)基因擴增陽性標本。

耐藥基因通過一些可以移動的基因元件如整合子、轉(zhuǎn)座子及質(zhì)粒在菌株之間水平轉(zhuǎn)移，導致細菌耐藥的迅速出現(xiàn)及傳播，已成為世界范圍內(nèi)所關注的嚴重的問題。整合子是一基因捕獲并表達元件，是由Stokes于1989年首次提出，被認為與細菌水平轉(zhuǎn)移耐藥基因密切相關。典型的整合子結(jié)構(gòu)是由保守區(qū)和可變區(qū)兩部分組成。保守區(qū)域即整合酶活性區(qū)域，具有整合和切除耐藥基因功能；可變區(qū)是由一系列串聯(lián)排列的耐藥基因盒組成[6]。整合子本身不可以移動，但是其常位于可移動基因成分如轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒上，從而介導耐藥基因水平轉(zhuǎn)移[7]。

本實驗通過對整合子可變區(qū)擴增、測序和比對分析發(fā)現(xiàn)了一個新的整合子排列形式。該整合子攜帶 aac(6’)II、aadA13和 oxA10a耐藥基因，其中 aac(6’)II和aadA13分別編碼氨基糖苷類乙酰轉(zhuǎn)移酶，表現(xiàn)對氨基糖苷類耐藥，oxA10a編碼β-內(nèi)酰胺酶，表現(xiàn)對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥。耐藥表型結(jié)果與PA091701整合子所攜帶耐藥基因相一致，但是耐藥表型顯示的氯霉素及左氧氟沙星的耐藥，整合子并沒有攜帶相關基因，提示銅綠假單胞菌耐藥機制比較復雜，除整合子外還存在其它耐藥機制[8]。值得注意的是，雖然本實驗首次報道了aac(6’)II、aadA13和oxA10a基因盒組合形式，但是這些相應耐藥基因盒早已經(jīng)在革蘭陰性桿菌中廣泛分布；此外，國內(nèi)南京地區(qū)曾首次在銅綠假單胞菌報道了 aac(6’)II、aadA13、clmA8 及 oxA10a基因盒排列形式[9]，而本次鎮(zhèn)江地區(qū)報道基因盒排列比南京地區(qū)報道的基因盒排列缺少一clmA8基因，形成這一原因具體機制并不十分清楚，推測認為這一現(xiàn)象可能與在抗生素選擇壓力下整合子可以不斷地整合或切除耐藥基因以使菌株更容易適應環(huán)境有關。

[1]Hall RM.Mobile gene cassettes and integrons moving antibiotic resistance genes in gram-negative bacteria [J].Ciba Found Symp,1997,207:192-202.

[2]Rowe-Magnus DA,Guerout AM,Mazel D.Bacterial resistance evolution by recruitment of super-integron gene cassettes[J].Mol Microbiol,2002,43(6):1657-1612.

[3]顧 兵,童明慶.整合子與細菌耐藥[J].臨床檢驗雜志,2005,23(3):83-86.

[4]Barlow RS,Pemberton JM,Desmarchelier PM,et al.Isolation and characterization of integron-containing bacteria without antibiotic selection[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48:838–842.

[5]Wang CY,Jerng KY,Chen LN,et al.Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalized patients: clinical features,risk-factors and outcomes[J].Clin Microbiol Infect,2006,12:63-68.

[6]唐吉斌,宋有良.整合子與鮑曼不動桿菌多重耐藥機制研究進展[J].醫(yī)學綜述,2009,15(7):984-987.

[7]蔡 挺,張 順,陳 琳,等.鮑氏不動桿菌耐藥基因和整合子、轉(zhuǎn)座子遺傳標記及菌株親緣性研究 [J].中華醫(yī)院感染學雜志,2007,17(10):1181-1184.

[8]許宏濤,張秀珍.醫(yī)院感染銅綠假單胞菌多重耐藥機制的研究[J].中國抗感染化療雜志,2005,5(3):141-145.

[9]Yuan W,Hui L,Jun L,et al.Detection of Pseudomonas aeruginosa carried a new gene cassette array within class I integron isolated from a teaching hospital in Nanjing,china[J].J Microbiol,2008,46(6):687-691.

Detection and analysis of novel gene cassette array in one clinical isolate of Pseudomonas aeruginosa

SUN Guangming,ZHU Guifang,CHANG Yueqin.Department of Clinical Laboratory,The Fourth Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University,Zhenjiang 212001,China

Objective To investigate the presence of resistant integron containing gene casstte arrays of Pseudomonas aeruginosa PA091701 and its association with multi-drug resistance.Methodes Susceptibility to antibiotics was determined by disk diffusion method and the presence of integron containing gene cassettes was tested by PCR.ResultsAmong the tested antibiotics,PA091701 was sensitive to polymyxin,intermediated susceptibility to imipenem and piperacillin/tazobactam,and resistance to other antibiotics.Sequence analysis of gene cassette array revealed the presence of novel gene cassette array containing aac(6＇)II,aadA13 and oxA-10a genes in PA091701,and logged in GenBank:JN118546.Conclusions The muti-drug resistance of PA091701 may be related to the gene cassettes haboured in integron,and it also involved other resistance mechanisms except integron.

Pseudomonas aeruginosa；Integron；Resistance

R378.99+1,R446.5

A

1674-1129(2011)05-0489-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2011.05.010

江蘇省鎮(zhèn)江市社會發(fā)展規(guī)劃，編號：2010041

孫光明，1975年出生，主管檢驗技師，2006年安徽醫(yī)科大學臨床檢驗診斷學碩士畢業(yè)，2010就讀于江蘇大學臨床檢驗診斷學專業(yè)博士學位，研究方向為細菌耐藥。