顏肇揚

(福建省德化縣中醫(yī)院，福建 德化 362500)

86株流感嗜血桿菌分離鑒定及耐藥性分析

顏肇揚

(福建省德化縣中醫(yī)院，福建 德化 362500)

目的探討適合臨床實際的流感嗜血桿菌分離鑒定方法，并了解本地區(qū)社區(qū)獲得性下呼吸道感染患者分離的流感嗜血桿菌耐藥性。方法常規(guī)培養(yǎng)并結(jié)合標本直接涂片革蘭染色鏡檢挑選可疑菌落，衛(wèi)星試驗和V+X、V、X因子需求試驗進行初步鑒定，法國生物梅里埃公司API NH鑒定板條進行復核鑒定；K-B法藥敏，結(jié)果判斷依據(jù)CLSI2010版標準；Nitrocefin法測定β內(nèi)酰胺酶。結(jié)果86份流感嗜血桿菌培養(yǎng)陽性標本直接涂片鏡檢均為合格標本，并可見大量WBC吞噬和/或伴行革蘭陰性小桿菌(形似流感嗜血桿菌)。86株流感嗜血桿菌中產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶17株，產(chǎn)酶率19.8%；對測試的8種藥物中，復方新諾明敏感性最低(38.4%)，其次為氨芐西林(73.3%)、阿奇霉素(83.7%)和頭孢呋辛(84.9%)，對亞胺培南、阿莫西林/克拉維酸、左旋氧氟沙星和頭孢噻肟敏感性較好，均在95%以上。結(jié)論實驗室人員應重視標本直接涂片鏡檢，并結(jié)合培養(yǎng)提高HIN分離率。HIN對常用抗生素的耐藥率應引起臨床醫(yī)師重視，注意合理使用抗菌藥物。

流感嗜血桿菌；直接涂片；革蘭染色；耐藥性；β-內(nèi)酰胺酶

流感嗜血桿菌 (Haemophilus influenzae，HIN)為人類社區(qū)獲得性呼吸道感染的常見致病菌，主要引起人類中耳炎、肺炎、咽炎、及其他呼吸道感染等疾病[1]。隨著抗生素濫用日趨嚴重，流感嗜血桿菌的耐藥性受到普遍關(guān)注。本文對本院2007年1月至2011年1月間分離自社區(qū)獲得性呼吸道感染患者的流感嗜血桿菌及體外藥物敏感試驗資料進行回顧性分析,以期為臨床合理用藥提供依據(jù)。結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 標本來自我院2007年1月至2011年1月呼吸內(nèi)科住院48h內(nèi)患者及門診患者合格呼吸道標本788份,包括自然咳痰、導管吸痰、支氣管纖維鏡保護性毛刷刷取物、支氣管肺泡灌洗液等。

1.2 試劑 血平板、巧克力平板(含5mg/100ml萬古霉素)為本實驗室自行配置，培養(yǎng)基半成品購自英國Oxoid公司、HTM藥敏專用培養(yǎng)基購自美國BD公司，API NH鑒定板條購自法國生物梅里埃公司，藥敏紙片、V+X、V、X因子均購自英國Oxoid公司。

1.3 菌株分離與鑒定

1.3.1 標本接種培養(yǎng) 送檢標本立即直接涂片濕片觀察細胞種類和數(shù)量，依據(jù)全國臨床檢驗操作規(guī)程第3版判斷標準，若合格可接受則接種血平板和巧克力平板，置于35℃，5%CO2培養(yǎng)24h。

1.3.3 標本直接涂片染色鏡檢 參考文獻對所有標本均進行直接涂片革蘭染色鏡檢[2]。取標本膿性部分少許，接種環(huán)直接涂抹玻片，自然干燥、火焰固定，鏡檢。油鏡下若見大量形態(tài)單一、革蘭陰性小桿菌(點狀、小桿狀)，且與WBC伴行和/或能見吞噬現(xiàn)象(圖1)，則可疑為流感嗜血桿菌。

圖1 大量WBC，伴行和/或吞噬G陰性小桿菌(箭頭所示)，形似流感嗜血桿菌

1.3.2 可疑菌落挑選 挑取血平板上不生長、巧克力平板上生長的透明或半透明、扁平、濕潤的露滴狀菌落。革蘭染色形態(tài)及大小與標本直接涂片可疑菌體類似即為可疑菌落。

1.3.3 衛(wèi)星試驗及V、X、X+V因子需求試驗，操作按全國臨床檢驗操作規(guī)程第3版要求進行。

1.3.4 根據(jù)直接涂片染色鏡檢、菌落形態(tài)、衛(wèi)星試驗及因子需求試驗等特點進行菌株鑒定。

1.3.5 菌株復核鑒定 采用法國生物梅里埃公司API NH鑒定板條進行，操作按說明進行。

1.4 β-內(nèi)酰胺酶測定 采用頭孢硝噻吩法，操作按照說明書進行。

1.5 體外藥敏試驗 采用K-B法分別進行阿奇霉素(AZI)、氨芐西林(AMP)、復方新諾明(SXT)、頭孢呋辛(CXM)、頭孢噻肟(CTX)、亞胺培南(IPM)、左旋氧氟沙星(LEV)、阿莫西林/克拉維酸(AMC)8種藥物的敏感性測定，按CLSI2010版的標準來判定試驗結(jié)果。

1.6 室內(nèi)質(zhì)量控制 選取ATCC49247為質(zhì)控菌株對上述實驗過程進行全程質(zhì)控。

1.7 統(tǒng)計分析 采用WHONET 5.4版專用統(tǒng)計軟件進行。

2 結(jié)果

2.1 788份標本中，86份標本HIN培養(yǎng)陽性，陽性率10.9%；包括自然咳痰69份，導管吸痰8份，支氣管纖維鏡保護性毛刷刷取物5份，支氣管肺泡灌洗液4份。

2.2 86例HIN感染患者一般臨床資料 86例患者，其中男性59例，女性27例，年齡14～89歲。48例(55.8%)有基礎(chǔ)病包括慢性阻塞性肺病、支氣管擴張癥等，38例(44.2%)為單純社區(qū)獲得性肺炎。

2.3 β-內(nèi)酰胺酶檢測 86株流感嗜血桿菌中檢出17株β-內(nèi)酰胺酶陽性，產(chǎn)酶率為19.8%。

2.4 流感嗜血桿菌對8種抗生素體外藥物敏感試驗結(jié)果見表1。

表1 86株流感嗜血桿菌耐藥性分布

3 討論

HIN是社區(qū)獲得性呼吸道細菌性感染的重要病原菌之一。有研究表明，HIN可以通過纖毛與非纖毛黏附素黏附和侵入到呼吸道上皮細胞，又通過外膜蛋白的改變逃脫中性粒細胞和巨噬細胞的吞噬,從而在呼吸道長期定植[3]。當患者免疫力下降，尤其是合并有基礎(chǔ)病如慢性阻塞性肺病(COPD)、支氣管擴張癥等時，HIN可侵犯下呼吸道，導致感染的發(fā)生。本組資料中，超過50%的患者合并有上述基礎(chǔ)病。

HIN對營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)條件苛刻。能否分離到HIN及分離率的高低成為衡量實驗室水平的重要標志[4]。對下呼吸道感染者，HIN在國內(nèi)尤其是綜合性醫(yī)院分離率不高，臨床分離株多來自上呼吸道輕癥感染者咽拭子標本。迄今為止，對HIN分離培養(yǎng)條件的探索研究日臻成熟，但實際上單純依賴培養(yǎng)并不能避免漏檢和假陽性出現(xiàn)。一方面，由于抗菌藥物濫用嚴重，相當比例的患者在培養(yǎng)前接受過不同種類、療程不等的抗菌藥物經(jīng)驗性治療 (自行或醫(yī)囑)。而經(jīng)驗性治療的直接后果是導致HIN部分或完全殺滅/抑制，從而漏檢，分離率下降；另一方面，實驗室人員感性認識積累不夠，尤其是對受抗菌藥物抑制而未呈現(xiàn)優(yōu)勢生長的情況容易忽略而漏檢；第三，隨著HIN高選擇性培養(yǎng)基的大量使用，使一些上呼吸道標本中定植的HIN很容易被分離而導致假陽性。本組資料對高危人群合格呼吸道標本HIN分離率達10.9%，86份呼吸道標本在接種培養(yǎng)同時均進行直接涂片革蘭染色，鏡檢結(jié)果表明，所有標本均為合格可接受(WBC＞25個，SEC＜10個/LP)，均可見大量WBC伴行大量染色、形態(tài)單一，細小桿菌或球桿菌，并可見明顯吞噬現(xiàn)象(圖1)。結(jié)合社區(qū)獲得性下呼吸道感染病原體流行病學資料，不難推斷，涂片所見流感嗜血桿菌概率極大。依據(jù)涂片結(jié)果指引，仔細觀察生長情況，有的放矢，可最大限度避免漏檢。

長期以來,氨芐西林和阿莫西林是治療HIN感染的最常用首選藥物，上世紀七十年代HIN對氨芐西林耐藥首次在歐洲被報道，隨后全世界均有這方面的報道。近年來，國內(nèi)報道該菌對氨芐西林的耐藥率也在逐年增加,且不同地區(qū)間存在差別[5，6]。本文的結(jié)果表明，HIN對復方新諾明敏感性最低(38.4%)，提示該藥不宜作為經(jīng)驗治療選用。其次，HIN對氨芐西林(73.3%)、阿奇霉素(83.7%)和頭孢呋辛(84.9%)，而對亞胺培南、阿莫西林/克拉維酸、左旋氧氟沙星和頭孢噻肟敏感性較好，均在95%以上，經(jīng)驗應用上述藥物治療HIN感染應具有確切的療效。HIN對氨芐西林的主要耐藥機制是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,目前研究認為流感嗜血桿菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶以質(zhì)粒介導的TEM-1型酶為主，小部分產(chǎn)ROB-1型酶[7]。HINβ-內(nèi)酰胺酶檢測陽性可預測該菌對青霉素、氨芐西林、阿莫西林耐藥，氨芐西林的藥敏結(jié)果可預測阿莫西林的敏感性。本組資料顯示細菌對氨芐西林的耐藥率達20.9%，產(chǎn)酶率19.8%，提示產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥的主要機制。此外，在氨芐西林耐藥的HIN菌株中存在一種稱為β-內(nèi)酰胺酶陰性氨芐西林耐藥 (β-lactamase-negative and ampicillin resistant，BLNAR)菌株，主要由于青霉素結(jié)合蛋白的改變和外膜蛋白通透性的下降而介導耐藥性產(chǎn)生[8]。本組資料中，氨芐西林耐藥的HIN有一株未檢出β內(nèi)酰胺酶，其具體耐藥機制，是否為BLNAR株有待進一步研究。

綜上所述，本文認為實驗室應重視標本直接涂片工作，結(jié)合涂片和培養(yǎng)兩方面的信息可有效的最大程度避免HIN漏檢和假陽性出現(xiàn)，提高HIN感染的分離率和病原學診斷的準確性。HIN對常用抗生素的耐藥率應引起臨床醫(yī)師重視，注意合理使用抗菌藥物。

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R378.4,R446.5,Q939.92

A

1674-1129(2011)04-0379-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2011.04.018

顏肇揚，男，41歲，主管技師，畢業(yè)于福建醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗專業(yè)，從事醫(yī)學檢驗工作，主攻臨床微生物學檢驗。