丁 露，黃小林，陳開森，廖晚珍，胡雪飛，胡妮婭

(1、南昌大學公共衛(wèi)生學院2007級；2、南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006)

金黃色葡萄球菌生物膜形成與ica操縱子關(guān)系探討

丁 露1，黃小林1，陳開森2，廖晚珍2，胡雪飛2，胡妮婭2

(1、南昌大學公共衛(wèi)生學院2007級；2、南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006)

目的了解不同部位分離金黃色葡萄球菌在不同時間生物膜形成與ica操縱子關(guān)系。方法采用結(jié)晶紫法測定不同部位在不同時間形成生物膜的含量；采用PCR法測定菌株是否含有ica基因。結(jié)果生物膜形成能力強的菌株則ica基因大部分為陽性。結(jié)論含有ica基因的金黃色葡萄球菌則生物膜形成的能力較強。

金黃色葡萄球菌；生物膜；ica操縱子

細菌生物膜是一種重要的毒力因子，在部分病原體的慢性感染中具有重要作用，特別是由于介入手術(shù)的開展，導致毒力強的金黃色葡萄球菌(Staphycoccus aureus)容易進入體內(nèi)，引發(fā)潛在的疾病和炎癥。金黃色葡萄球菌是臨床常見的革蘭陽性致病菌，易引起侵襲性疾病，如果形成了生物膜可導致慢性遷延性發(fā)展。我們先前的研究證實，不同部位分離的金黃色葡萄球菌在不同時間形成生物膜的能力不同[1]。

實際上，細菌生物膜的形成受到外界因素的影響，同時也受本身基因的調(diào)控，有研究證實ica操縱子與葡萄球菌生物膜形成具有重要關(guān)系，但也可獨立于ica之外的機制。我們對50株不同部位分離的金黃色葡萄球菌進行ica操縱子的檢測，以了解本地區(qū)ica及與金黃色葡萄球菌形成生物膜的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 金黃色葡萄球菌菌株 共計50株，其中血液、痰液、尿液、創(chuàng)面分泌物和生殖道分泌物各計10株。所有菌株為患者標本且都為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。

1.2 MR金黃色葡萄球菌生物膜實驗方法 見文獻[1]。

1.3 ica-PCR檢測是否具有ica基因 TaqDNA聚合酶、dNTPs、5×TBE液為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品，icaADB 基因擴增引物 1：5＇-TTATCAATGCCCAGTTGTC-3＇， 引 物 2：5＇-GTTTAACGCCAGTGCGCTAT-3＇，由上海生工生物工程有限公司合成，ABI5700PCR擴增儀為美國產(chǎn)品，凝膠成像系統(tǒng)為北京君意東方電泳分析儀設備有限公司產(chǎn)品，低溶點瓊脂糖為加拿大BBI公司產(chǎn)品。直徑為90mm的一次性無菌培養(yǎng)皿購自江蘇揚州醫(yī)療器械有限公司。

1.4 ica-PCR方法 挑取血平板上2～3個菌落(24h)于2～3ml生理鹽水中制成菌懸液，使其濃度為2.5×106CFU/ml左右，按細菌DNA提取試劑盒要求提取DNA。 PCB 反 應 體 系 共 50μl：10× 緩 沖 液 5μl，15mmol／L MgCl 2.5μl，菌液 5μl，dNTPl.5μl，引物各1μl，Taq 酶 0.5U，H2O 30.5μl。循環(huán)參數(shù)為：93℃預變性 6min；93℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 1min， 循環(huán) 35次，最后72℃延伸6min。反應結(jié)束后取產(chǎn)物10μl，以2%瓊脂糖進行電泳，120V電壓下電泳30min后，以凝膠成像系統(tǒng)成像分析。

2 結(jié)果

2.1 具有ica操縱子的菌株 血液6株，痰液7株，尿液10株，創(chuàng)面分泌物9株，生殖道分泌物9株。

2.2 不同時間不同部位生物膜形成能力與ica因子關(guān)系見表1。

表1 不同時間不同部位生物膜形成能力與ica因子關(guān)系

2.3 ica操縱子電泳圖譜(624bp)(見圖1)。

圖1 ica操縱子電泳圖譜(624bp)

3 討論

金黃色葡萄球菌是臨床常見的致病菌，在我院2008年細菌耐藥監(jiān)測中占革蘭陽性菌的第2位，僅次于表皮葡萄球菌[2]，表明我院金黃色葡萄球菌感染較為嚴重。另外，我們檢測的細菌及進行藥物敏感性實驗是將細菌建立在浮游狀態(tài)下，所得結(jié)果往往與細菌存在于體內(nèi)情況不符合，表現(xiàn)為細菌容易形成生物膜。故有必要了解細菌生物膜形成的成因[3，4]。

金黃色葡萄球菌生物膜的形成機制非常復雜，不但與外界因素有關(guān)，同時也與細菌本身基因的表達及形成的多種蛋白質(zhì)參與有關(guān)。生物膜的形成包括黏附、聚集、形成、發(fā)展和最終形成，任何一個步驟都存在外在因素影響和內(nèi)部基因的調(diào)控[5]。例如，在聚集及生物膜成熟階段主要是依靠促進細菌相互聚集的多糖黏附素，特別是多糖胞間黏附素(PIA)發(fā)揮重要作用。PIA主要由ica操縱子內(nèi)基因表達的酶進行生物合成，我們的實驗共檢測了50株分別來自血液、唾液、尿液、創(chuàng)面分泌物以及生殖道分泌物的菌株，并且無論是對哪類標本的檢測結(jié)果都能證實ica操縱子的表達與生物膜含量具有密切關(guān)系(見表1)，即ica操縱子的表達高的菌株隨著時間的延長形成生物膜的量增多，也即表現(xiàn)為含ica因子的金黃色葡萄球菌生物膜形成能力隨時間的延長而增強，與文獻[6]相似。同時我們對不同來源的標本進行了不同時間不同部位生物膜形成能力與ica因子關(guān)系比較發(fā)現(xiàn)，各組標本檢測結(jié)果都能證實ica操縱子的表達與生物膜含量具有密切關(guān)系(見表1)，其中以尿液組最為明顯，可能的原因是尿液感染主要是以革蘭陰性菌為主，特別是腸桿菌科細菌為主要的感染細菌，如果尿路出現(xiàn)了金黃色葡萄球菌感染，則表現(xiàn)為宿主的尿路局部免疫能力可能處于一個相對低下的狀態(tài)。這種情況是否影響到了金黃色葡萄球菌與生物膜形成的有關(guān)基因的表達，例如ica操縱子的生物表達，值得深入探討。另外在早期的感染中創(chuàng)面分泌物分離的ica陽性金黃色葡萄球菌形成的生物膜的能力強于生殖道分泌物分離的標本，而在后期測定中生殖道分泌物分離的MRSA形成生物膜的能力相似于前者，具體原因值得探索[1]。但我們也發(fā)現(xiàn)檢測出ica因子但生物膜能力有下降情況(見表1)，ica操縱子由緊密相連的icaA、icaD、icaB和icaC四個基因組成，icaA是膜蛋白質(zhì)，具有N-乙酰葡聚糖轉(zhuǎn)移酶活性，icaB是分泌蛋白質(zhì)，icaC、icaD是膜蛋白質(zhì)，這四種蛋白質(zhì)共同作用合成PIA形成生物膜。但這四個基因受到上游調(diào)節(jié)基因icaR的作用，且這種作用受到外界因素的影響。例如NaCl可誘導非耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜的形成比耐甲氧西林金黃色葡萄球菌要顯著，這主要是因為NaCl在非耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中是ica操縱子轉(zhuǎn)錄的激活劑，而耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的生物膜形成主要由葡萄糖誘導產(chǎn)生。在本實驗中，我們直接進行了ica操縱子基因檢測，由于該基因的表達可存在沉默現(xiàn)象[7]，故我們進行ica操縱子基因檢測在少數(shù)情況下并不能真實地反應出對應蛋白表達情況。

[1]陳開森,黃小林,丁 露.不同時間段臨床分離MRSA生物膜形成能力的探討[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2011,29(1):37-38.

[2]陳開森,廖晚珍,彭衛(wèi)華,等.昌大一附院2008年細菌耐藥監(jiān)控[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2009,27(5):481-484.

[3]陳維賢,張莉萍.細菌生物被膜(bacterial biofilm)的研究進展[J].微生物學雜志,2004,1:46-48.

[4]邱瑜蕾,包崇云.生物材料表面細菌生物膜形成與理化特征[J].國際口腔醫(yī)學雜志,2008,1:76-79.

[5]唐俊妮,周 銳,王紅寧,等.葡萄球菌生物膜形成機制與ica之間的關(guān)系[J].微生物學通報,2008,8:1287-1291.

[6]Beenken KE,Dunman PM,McAleese F,et al.Global gene expression in Staphylococcus aureus biofilm[J].J Bacteriol,2008,186(37):4665-4684.

[7]Yarwood JM,Bartels DJ,Volper EM,et al.Quorumsensing in Staphylococcus aureus biofilms[J].J Bacteriol,2004,186(6):1838-1850.

Relationship between formation of Staphylococcus aureus biofilm and ica operon

DING Lu,HUANG Xiaolin,CHEN Kaisen,et al.Grade 2007,School of Public Health of Nanchang University,Nanchang 330006,China

ObjectiveTo understand the relationship between the biofilm formation of Staphylococcus aureus separated from the clinical specimens in different parts or time and ica operon.MethodsThe crystal violet method was performed to determine the content of biofilm formation in different parts or time;PCR method was used to determine whether strains contains ica genes.ResultsThe strains possessing the stronger ability of biofilm formation were tested positive for most of the ica genes.ConclusionBiofilm formation ability is stronger in Staphylococcus aureus containing ica genes.

Staphylococcus aureus；Biofilm；ica operon

R344+.14,R378.1+1

A

1674-1123(2011)04-0353-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2011.04.007

南昌大學校級課題YF05(2008)

丁露，女，1988年8月出生，現(xiàn)就讀于南昌大學公共衛(wèi)生學院醫(yī)學檢驗專業(yè)。

陳開森，1975年出生，男，漢族，江西省武寧人，醫(yī)學碩士。主要研究方向：細菌耐藥機制。