馬占玲，顧佳麗，曾凌

(渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧錦州，121013)

目前有不少測定蛋白質(zhì)的方法，如凱氏定氮法、分光度法［1－6］、熒光法［7］和新發(fā)展起來的共振瑞利光散射分析法［8－9］等。分光光度法因其簡便、快速、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確等特點而得到廣泛應(yīng)用。其中應(yīng)用最多的是考馬斯亮藍(lán)法。染料結(jié)合法也是一種簡便而常用的方法，目前文獻(xiàn)報道的染料有:曙紅［10］、茜素紅、四溴螢光黃二鈉鹽、鈣黃綠素［11］、偶氮胂(Ⅲ)-鑭(Ⅲ)［12］等。但這些方法均存在受雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，操作復(fù)雜，不穩(wěn)定等缺點。本文研究了一種新的測定牛奶中蛋白質(zhì)的光度分析法——鄰苯三酚紅-銅絡(luò)合物法，采用該方法測定牛奶中的蛋白質(zhì)含量，獲得較理想的分析結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試劑

牛血清白蛋白(BSA)，上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司;鄰苯三酚紅、CuSO4(均為分析純)。

1.2 儀器

756紫外-可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。

1.3 實驗方法

在中性條件下，鄰苯三酚紅與銅絡(luò)合生成紫色絡(luò)合物，加入BSA或牛奶后顏色變深。分別測定增色前后吸光度值，然后求出吸光度差值ΔA。因為ΔA與蛋白質(zhì)的濃度成正比，進(jìn)而求出樣品中蛋白質(zhì)的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液在最佳條件下使鄰苯三酚紅銅的絡(luò)合體系增色，用去離子水做參比，對增色體系進(jìn)行波長掃描，確定最大吸收波長，結(jié)果見圖1。

圖1 最大吸收波長掃描圖

從圖1看出，吸收曲線呈不規(guī)則拋物線形，在200～800 nm有2個吸收峰。本實驗選擇第2個吸收峰所對應(yīng)的波長517 nm為測量波長。

2.2 最佳實驗條件的確定

2.2.1 鄰苯三酚紅最佳用量的確定

在固定其他顯色條件不變的前提下，只改變鄰苯三酚紅溶液的體積V鄰，測其吸光度。同時測定未加牛血清白蛋白工作液體系的吸光度，計算兩溶液的吸光度之差ΔA，結(jié)果見圖2。

圖2 鄰苯三酚紅用量對吸光度差值的影響

從圖2看出，鄰苯三酚紅的體積在0～2.00 mL，ΔA隨鄰苯三酚紅用量的增加而增大，鄰苯三酚紅溶液的體積在2.00 mL后吸度差值變化不大，因此選擇2.00 mL為鄰苯三酚紅溶液的最佳用量。

2.2.2 CuSO4溶液的用量

按實驗步驟操作，只改變CuSO4溶液的用量，考察它對吸光度之差ΔA的影響。在0.00～0.80 mL，ΔA隨CuSO4溶液體積的增加逐漸增大，在0.80 mL時達(dá)到最大值。當(dāng)體積大于0.80 mL后，吸光度差值逐漸減小。因此選擇0.80 mL為CuSO4的最佳用量。即鄰苯三酚紅與Cu2+的最佳摩爾比是5∶2。

2.2.3 加熱溫度的確定

取2個50 mL容量瓶，加入14.00 mL鄰苯三酚紅－Cu2+混合溶液，一只容量瓶中加入5.00 mL牛血清白蛋白工作液，另一只容量瓶不加。在不同溫度下放置10 min，然后在517 nm處測量其吸光度之差ΔA。試驗發(fā)現(xiàn)，ΔA在10～30℃變化較小，30℃以后逐漸減小，因此選擇20℃為測量溫度。

2.2.4 反應(yīng)時間的確定

按實驗操作步驟，顯色體系在室溫下靜置不同時間后立刻用紫外可見分光光度計在517 nm處測量其吸光度之差ΔA，考察時間對吸光度差值的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 反應(yīng)時間對△A的影響

由圖3可見，反應(yīng)在5～50 min，ΔA隨時間的延長而變化不大，可見反應(yīng)體系比較穩(wěn)定。綜合考慮，選擇反應(yīng)時間為10 min。

2.3.5 工作曲線的繪制

取6個 10 mL比色管，分別加入 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液和2.80 mL鄰苯三酚紅與CuSO4的混合溶液;在最佳實驗條件下進(jìn)行顯色，測量。以牛血清白蛋白的濃度為橫坐標(biāo)，ΔA為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。得到工作曲線方程為 ΔA=0.01c－0.025 5，相關(guān)系數(shù)為0.990 3。

2.3.6 樣品測定

采用本方法對市售牛奶進(jìn)行測量，同時采用國標(biāo)法——乙酰丙酮，甲醛法進(jìn)行對比試驗，結(jié)果見表1。

表1 樣品測定結(jié)果

由表1可見，采用鄰苯三酚紅－銅(Ⅱ)法測定牛奶中蛋白質(zhì)的含量與國標(biāo)法相比，誤差在1.8% ～2.8%，準(zhǔn)確度較高，而且精密度較好，相對平均偏差在1.61%～2.58%。

2.3.7 回收率的測定

4個加標(biāo)回收實驗測得結(jié)果見表2?；厥章试?3.1% ～108.5%，在光度允許誤差范圍之內(nèi)。

表2 回收率的測定

3 結(jié)論

采用中性鄰苯三酚紅－銅(Ⅱ)絡(luò)合體系測定牛奶中蛋白質(zhì)含量，方法準(zhǔn)確度較高，精密度也較好，而且顯色體系比較穩(wěn)定。采用該方法測定多種牛奶樣品中的蛋白質(zhì)含量，與國標(biāo)法比較，結(jié)果令人滿意。

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