趙婷，李輝，程池

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100027)

二級(jí)結(jié)構(gòu)相比核苷酸一級(jí)序列具有更高的穩(wěn)定性，對(duì)于維系生物功能性極為重要。近年來(lái)，16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)圖形分析用于微生物分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析逐步發(fā)展起來(lái)?？莶菅挎邨U菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，產(chǎn)生多種蛋白酶、淀粉酶、麥芽糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶等［1－2］?？莶菅挎邨U菌(B．subtilis)的某些株為傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆的生產(chǎn)菌株。但是由于這兩個(gè)菌種16S rRNA基因同源性很高［3］，表型特征極其相似［4］，常規(guī)鑒定方法較難區(qū)分，本文通過(guò)16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)圖形分析比較，評(píng)估該方法用于區(qū)分枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)的可行性。

1 概念

16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)是指rRNA序列通過(guò)自身回折形成堿基配對(duì)的莖區(qū)(stem)以及不配對(duì)的發(fā)卡環(huán)(hairpin loop)、突環(huán) (bulge loop)、內(nèi)環(huán) (interior loop)、多支分環(huán)(multi-branched loop)等結(jié)構(gòu)。堿基配對(duì)的莖區(qū)對(duì)于二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起到重要作用，而各種環(huán)區(qū)的形成會(huì)破壞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

1981年，Woese等［5］以Escherichia coli的 16S rRNA序列為基礎(chǔ)，根據(jù)化學(xué)修飾、蛋白結(jié)合、酶切片段等試驗(yàn)數(shù)據(jù)，初步推斷并描述了16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)模型。1983年，Woese等［6］比較分析了真細(xì)菌域、古細(xì)菌域、真核生物域150余個(gè)物種的16S rRNA序列，論述了三域生物16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與能量及功能之間的關(guān)系，提出序列比較方法是預(yù)測(cè)假設(shè)結(jié)構(gòu)的有力工具。1993年，Neefs等［7］完善和改進(jìn)了Woese提出的模型，闡述了真細(xì)菌、古細(xì)菌、真核生物的核糖體小亞基的二級(jí)結(jié)構(gòu)模式圖及之間的區(qū)別。奧斯汀TEXAS大學(xué)Gutell實(shí)驗(yàn)室建立的Comparative RNA Web(CRW)Site 數(shù)據(jù)庫(kù)［8－9］，包含有最近更新的參照菌株E．coliJ01695的16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)模型，同時(shí)包括rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)模型的演變歷程、新舊結(jié)構(gòu)模型的比較信息、核苷酸序列及結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)等。rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)模型的建立揭示了微生物類群中核糖體結(jié)構(gòu)保守性一般大于序列保守性，并且二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與功能性緊密相關(guān)。

RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法主要包括最小自由能法和比較序列分析法。最小自由能算法是Zuker［10］在1981年提出的，發(fā)展至今已相當(dāng)成熟，使用方便，預(yù)測(cè)成功率高，基于RNA structure軟件預(yù)測(cè)。比較序列分析法，由 Mathias［11］和 Lowe［12］于 1998 年和 1997年分別提出，比較序列分析法可靠性較強(qiáng)，但其預(yù)測(cè)結(jié)果強(qiáng)烈依賴于多序列比對(duì)的結(jié)果，操作繁復(fù)，工作量大。目前流行的做法是把兩者結(jié)合起來(lái)使用。

2 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展

16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在微生物菌種分類及系統(tǒng)發(fā)育分析中有一定程度的應(yīng)用，Wisotzkey等［13］在1992年根據(jù)16S rRNA部分同源區(qū)段的二級(jí)結(jié)構(gòu)和脂肪酸類型從芽孢桿菌屬(Bacillus)屬劃分出一個(gè)新屬:脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus);1997年，MORI等［14］比較分析了Lactobacillus casei及其相關(guān)種16S rRNA 69位點(diǎn)至100位點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該區(qū)段存在種水平差異;2003年，郭春雷等［15］預(yù)測(cè)并比較了棲熱菌屬(Thermus)16S rRNA部分區(qū)段的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明在種水平存在內(nèi)環(huán)、發(fā)卡環(huán)間堿基對(duì)數(shù)目的差異;2006年，陳國(guó)忠等［16］分析比較了姜氏菌屬(Jiangella)及相關(guān)屬16S rRNA可變區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)圖形差異，結(jié)果表明在9個(gè)可變區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)中莖的長(zhǎng)度、環(huán)的數(shù)目和類型、莖的堿基對(duì)、環(huán)內(nèi)部堿基均有不同，認(rèn)為該方法可以區(qū)分屬以上水平原核生物。2006年，姜怡等［17］分析比較了閆氏菌科(Yaniaceae)16S rRNA可變區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)，提出在9個(gè)可變區(qū)中，有2個(gè)以上不同的結(jié)構(gòu)單元可以定為新科，有1個(gè)不同的結(jié)構(gòu)單元可以定為新屬。除16S rRNA外，其他RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分子標(biāo)志也有應(yīng)用，如2004年，Hong等［18］分析比較了靈芝屬(Ganoderma)線粒體小亞基V1、V4、V5、V6、V9可變區(qū)rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，認(rèn)為二級(jí)結(jié)構(gòu)用于分析靈芝屬系統(tǒng)發(fā)育線性關(guān)系是一個(gè)有力的工具;2007年，劉超洋等［19］分析了子囊菌門部分類群的18S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)特征，認(rèn)為二級(jí)結(jié)構(gòu)能更清晰地體現(xiàn)子囊果的演化歷程。

3 枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.lichenformis)的16S rRNA可變區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)比較

從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲取研究菌株序列信息，運(yùn)用Clustalx 1.83及RNA structure 4.6分析比較枯草芽孢桿菌(B．subtilis)ATCC 6051T(GenBank登錄號(hào):AB271744)和地衣芽孢桿菌(B.lichenformis)ATCC 14580T(GenBank登錄號(hào):CP000002)的 16S rRNA可變區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)，表1顯示枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.lichenformis)16S rRNA保守區(qū)序列位點(diǎn)差異，圖1～圖3顯示枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)16S rRNA可變區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)圖形。

表1 枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)16S rRNA保守區(qū)序列位點(diǎn)差異

3.1 V2可變區(qū)180－230區(qū)段50nt 16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)比較

B．subtilis由2個(gè)莖、2個(gè)發(fā)卡環(huán)、1個(gè)突環(huán)組成，B．lichenformis由3個(gè)莖、2個(gè)發(fā)卡環(huán)、1個(gè)內(nèi)環(huán)、1個(gè)突環(huán)組成，兩者結(jié)構(gòu)明顯不同，關(guān)鍵堿基第4位堿基B．subtilis為 G，B．lichenformis為 C，該堿基的不同引起了兩者結(jié)構(gòu)的改變，其他 8、27、43、44、45 位堿基的不同沒(méi)有引起兩者結(jié)構(gòu)的改變。

圖1 枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)V2可變區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)

3.2 V4可變區(qū)580－630區(qū)段50nt 16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)比較

B.subtilis由3個(gè)莖、2個(gè)內(nèi)環(huán)、1個(gè)發(fā)卡環(huán)、1個(gè)突環(huán)組成，B.lichenformis由3個(gè)莖、2個(gè)內(nèi)環(huán)、1個(gè)發(fā)卡環(huán)組成，兩者結(jié)構(gòu)明顯不同，關(guān)鍵堿基第12位堿基B.subtilis為 G，B.lichenformis為 C，第 15位堿基B.subtilis為 U，B．lichenformis為 G，這2 個(gè)堿基的不同引起了兩者結(jié)構(gòu)的改變。

圖2 枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)V4可變區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)

3.3 V9可變區(qū)1430－1480區(qū)段50nt 16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)比較

B．subtilis由4個(gè)莖、2個(gè)內(nèi)環(huán)、2個(gè)發(fā)卡環(huán)、1個(gè)突環(huán)組成，B．lichenformis由5個(gè)莖、3個(gè)內(nèi)環(huán)、2個(gè)發(fā)卡環(huán)、1個(gè)突環(huán)組成，兩者結(jié)構(gòu)明顯不同，關(guān)鍵堿基第41位堿基B．subtilis為 A，B．lichenformis該堿基缺失，該堿基的缺失引起了兩者結(jié)構(gòu)的巨大變化。

圖3 枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)V9可變區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)

綜上分析，枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在V2、V4、V9共3個(gè)可變區(qū)有明顯不同，表明16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析可以用于兩者種水平鑒別。

4 結(jié)語(yǔ)

16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析(圖形結(jié)構(gòu)差異)，基于現(xiàn)有的海量核酸序列信息，提供更多的系統(tǒng)發(fā)育信息，為微生物菌種分類提供了有一個(gè)有意義的分子指征。隨著更多更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)方法被開發(fā)出來(lái)，更多種屬樣本的驗(yàn)證數(shù)據(jù)，更多因素的評(píng)估，如假結(jié)、細(xì)胞組成、堿基修飾、轉(zhuǎn)錄過(guò)程等，16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)也會(huì)越來(lái)越廣泛地用于系統(tǒng)分類和進(jìn)化的研究。如2007年，Huang等［20］研究了包含假結(jié)的rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，Pfold等［21］試圖應(yīng)用將系統(tǒng)進(jìn)化樹來(lái)指導(dǎo)rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)并獲得了突破。

枯草芽孢桿菌(B．subtilis)ATCC 6051T和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)ATCC 14580T16S rRNA共有28個(gè)保守差異堿基位點(diǎn)，本文嘗試了所有差異位點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，只有文中選取的3個(gè)區(qū)段二級(jí)結(jié)構(gòu)有明顯差異。16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析可以在種水平對(duì)枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)進(jìn)行鑒別，期望為廣大生產(chǎn)企業(yè)及檢測(cè)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)對(duì)菌種的使用、標(biāo)識(shí)、檢測(cè)、鑒定提供理論及技術(shù)依據(jù)。

［1］ 飼料添加劑品種目錄.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1126號(hào)，2008.

［2］ NY/T 1461－2007飼料微生物添加劑地衣芽孢桿菌.

［3］ Fox G E，Wisotzkey J D，Jurtshuk P．How close is close:16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity［J］．Int J Syst Bacteriol，1992，42:166－170.

［4］ 東秀珠，蔡妙英．常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］．北京:科學(xué)出版社，2001:62－63.

［5］ Noller H F，Woese C R．Secondary structure of 16S ribosomal RNA［J］．Science，1981，212(4):403 － 411.

［6］ Woese C R，Gutell R，Noller H F，et al．Detailed analysis of the higher-order structrue of 16S-like ribosomal ribonucleic acids［J］．Microbiol Rev，1983，47(4):621 －669.

［7］ Neefs J M，Peer Y V D，Rijk D P，et al．Compilation of small ribosomal subunit RNA structure［J］．Nucleic Acids Res，1993，21(13):3 025 －3 049.

［8］ Comparative RNA Web Site:(http://www．rna．ccbb．utexas．edu).

［9］ Cannone J J，Subramanian S，Schnare M N，et al．The comparative RNA web(CRW)site:an online database of comparative sequence and structure information for ribosomal，intron，and other RNAs［J］．BMC Bioinformatics，2002，3(1):2.

［10］ Zuker M，Stiegler P．Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary information［J］．Nucleic Acids Res，1981，9(1):133 －148.

［11］ Mathias S，Carsten H，Melissa B，et al．Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA gene［J］．Nucleic Acids Research，1998，26(1):148 －153.

［12］ Lowe T M，Eddy S R．tRNAscan-SE:A program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence［J］．Nucleic Acids Research，1997，25(5):955 －964.

［13］ Wisotzkey J D，Jurtshuk P J，F(xiàn)ox G E，et al．Comparative sequence analyses on the 16S rRNA(rDNA)ofBacillus acidocaldarius，Bacillus acidoterrestris，andBacillus cyclohepatanicusand proposal for creation of a new genus，Alicyclobacillusgen．nov［J］．Int J Syst Bacteriol，1992，42:263－269.

［14］ Mori K，Yamazaki K，Ishiyama T，et al．Comparative Sequence Analyses of the Genes Coding for 16S rRNA ofLactobacilluscasei-Related Taxa［J］．Int J Syst Bacteriol，1997，47:54 －57.

［15］ Guo C L，Wang T，Zhu W，et al．The phylotype of thermos from the Rehai geothermal area，Tengching，China［J］．J Microbiol，2003，41(2):152 －156.

［16］ 陳國(guó)忠，姜怡，唐蜀昆，等．16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可變區(qū)圖形分析在放線菌分類中的應(yīng)用［J］．微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(2):184 －187.

［17］ 姜怡，唐蜀昆，徐麗華，等．閻氏菌科的16S rRNA可變區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析［J］．微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(5):176－182.

［18］ Soon G H，Hack S J．Phylogenetic analysis of Ganoderma based on nearly complete mitochondrial small-subunit ribosomal DNA sequences［J］．Mycologia，2004，96(4):742－755.

［19］ 劉超洋，莊文穎．rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)序列用于真菌系統(tǒng)學(xué)研究的方法初探［J］．菌物學(xué)報(bào)，2007，26(1):22 －31.

［20］ Huang X L，Hesham A．High sensitivity RNA pseudoknot prediction［J］．Nucleic Acids Research，2007，35(2):656－663.

［21］ Knudsen B，Pfold H J．RNA secondary structure prediction using stochastic context-free grammars［J］．Nucleic Acids Research，2003，31(13):3 423 －3 428.