馮英委，何志勇，陳潔，曾茂茂，秦昉，陶冠軍，王林祥

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

橄欖(Canarium albumL．Rauesch)，又名青果、白欖、黃欖、山欖。我國(guó)橄欖品種資源豐富，其與原產(chǎn)歐洲地中海地區(qū)的油橄欖(OleaeuropaeaL．)實(shí)為不同科屬的植物［1］。橄欖具有很高的食用藥用價(jià)值，屬衛(wèi)生部批準(zhǔn)的既是食品又是藥物的69種物品之一，具有解酒護(hù)肝、抗菌消炎、抗病毒、解毒、抑制血糖升高和增加骨密度與骨鈣含量等藥理功效，酚類化合物是其主要藥效成分［2］。

酚類化合物由于其分子含有酚羥基結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的抗氧化作用，不僅有益于人體健康，而且對(duì)于食品的抗氧化也具有潛在的積極作用。隨著工業(yè)化社會(huì)的發(fā)展，在崇尚綠色天然的消費(fèi)觀念下，人們?cè)桨l(fā)對(duì)天然提取物產(chǎn)生興趣。從天然產(chǎn)物中提取酚類化合物并開(kāi)發(fā)應(yīng)用于食品、制藥、生化、日化、精細(xì)化工、營(yíng)養(yǎng)、功能高分子材料等領(lǐng)域的研究已成為當(dāng)前熱點(diǎn)［3］。我國(guó)橄欖酚類物質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用尚處于起步階段，目前有關(guān)橄欖酚類物質(zhì)功能活性的研究報(bào)道較少，其抗氧化活性的評(píng)價(jià)方法體系還比較單一。本研究通過(guò)測(cè)試還原力、金屬離子螯合能力及4種不同自由基清除能力，以考察橄欖酚類提取物的抗氧化性能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福建檀香橄欖:無(wú)錫朝陽(yáng)果蔬批發(fā)市場(chǎng)采購(gòu);橄欖酚類提取物:新鮮橄欖去核，果肉打漿，再用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液攪拌提取，提取液經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥得到粗提物產(chǎn)品;橄欖酚類純化物:橄欖酚類粗提物用水溶解后上AB-8大孔樹(shù)脂純化，洗脫液經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥即得橄欖酚類純化物產(chǎn)品;2，2＇-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、1，1-二苯-2-苦基苯肼 (DPPH)、Fe3+-三吡啶三吖嗪(TPTZ)、3-(2-吡啶基)-5，6-雙(4-苯磺酸)-1，2，4-三嗪(Ferrozine)、6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(Trolox)、丁基羥基茴香醚(BHA)、Vc、沒(méi)食子酸，均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-2800H型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀器有限公司;TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;Lab Dancer圓周振蕩器，廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司;pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

分別稱取3 g橄欖酚類粗提物和1 g橄欖酚類純化物，以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶解并定容于100 mL的容量瓶中，各超聲10 min，離心取上清液備用。

1.2.2 樣品總酚含量的測(cè)定

精確吸取樣品液1 mL與Folin-Ciocalteu試劑2.5 mL于10 mL容量瓶，振搖混勻后放置5 min，加入碳酸鈉溶液(75 g/L)2 mL，用超純水定容后混勻。30℃下反應(yīng)2 h，于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，以超純水作為空白對(duì)照。以沒(méi)食子酸配制成10～50 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的總酚含量表示為與每毫升樣品溶液相當(dāng)?shù)臎](méi)食子酸(gallic acid equivalent，GAE)的毫克數(shù)(mg GAE/mL)［4］。

1.2.3 ABTS自由基(ABTS+·)清除能力的測(cè)定

工作液制備:用超純水將ABTS和高硫酸鉀分別溶解并混合，使其濃度分別為7 mmol/L和2.45 mmol/L，在室溫、避光條件下放置 12～16 h，形成ABTS自由基儲(chǔ)備液，使用前用磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.4)稀釋，使其 734 nm處吸光度為(0.700±0.020)。

測(cè)定方法:將橄欖酚類粗提物和純化物分別稀釋成不同濃度(0.01、0.02、0.03、0.05 和 0.1 mg/mL)，以BHA和Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。精確吸取樣品稀釋液0.1mL，加入3.9mL ABTS工作液充分混合，在30℃反應(yīng)10 min后，于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值得A1，以超純水作空白得A0，計(jì)算ABTS自由基清除率。以0～1 000μmol/L的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的ABTS自由基清除能力用TEAC值(trolox equivalent antioxidant capacity)表示［5］。

1.2.4 DPPH自由基(DPPH·)清除能力的測(cè)定

試劑配制:用無(wú)水乙醇溶解9.858 mgDPPH并定容至25 mL的棕色容量瓶，配置成1 mmol/L的溶液，冷藏放置。用無(wú)水乙醇稀釋10倍使用。

測(cè)定方法:將橄欖酚類粗提物和純化物分別稀釋成不同濃度(0.001、0.005、0.01、0.02 和 0.1 mg/mL)，以BHA和Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。將2 mL超純水和2 mL樣品液分別加入等體積DPPH溶液(0.1 mmol/L)，振蕩混合，30℃條件下反應(yīng)30 min后在517nm測(cè)定吸光值，得到A0和A1。A2由2 mL樣品液加入等體積無(wú)水乙醇測(cè)定，計(jì)算DPPH自由基清除率。以0～40μmol/L的trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的 DPPH自由基清除能力用 TEAC值表示［6］。

DPPH·清除率/%=［1－(A1－A2)/A0］×100

1.2.5 羥自由基(·OH)清除能力測(cè)定

采用氧化鄰二氮菲-Fe2+法［7］，將橄欖酚類粗提物和純化物分別稀釋成不同濃度(0.01、0.02、0.05、0.1和0.2 mg/mL)，以BHA和Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。取5 mmol/L鄰二氮菲1.0 mL加入試管，再加入0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液2.0 mL和樣品溶液1.0 mL，充分混勻。再加入7.5 mmol/L的FeSO4溶液1.0 mL，并立即混勻。再加入0.1%H2O21.0 mL，混勻后37℃保溫1 h，于536 nm處測(cè)其吸光值A(chǔ)1，用同體積的超純水代替樣品液得空白對(duì)照A0。

試劑配制:稱取 0.1261 g鄰苯三酚，溶于10 mmol/L的HCl溶液，并以10 mmol/L的HCl定容到100 mL混勻，得到10 mmol/L的鄰苯三酚溶液。

測(cè)定方法:將橄欖酚類粗提物和純化物分別稀釋成不同濃度(0.05、0.1、0.2、0.5 和 1 mg/mL)，以BHA和Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。參照文獻(xiàn)［6］方法略改進(jìn)，取0.1 mL樣品，加入1.8 mL的Tris-HCl緩沖液(pH 8.2、50 mmol/L)，再加入 2 mL 超純水，混勻后在25℃水浴中保溫10 min，再加入0.1 mL的鄰苯三酚溶液(10 mmol/L)，立即混勻，于320 nm下測(cè)定吸光值。從加入鄰苯三酚后30 s開(kāi)始讀數(shù)，以后每隔30 s讀數(shù)一次，直到第4 min結(jié)束。以時(shí)間和吸光值分別為橫、縱坐標(biāo)作圖，得到的曲線斜率計(jì)為△A1，以超純水為空白對(duì)照，得到的斜率計(jì)為△A0。

1.2.7 鐵離子還原能力的測(cè)定(FRAP)

試劑配制:10 mmol/L的 TPTZ儲(chǔ)備液(用40 mmol/L的鹽酸溶解)，20 mmol/L的 FeCl3溶液和0.3mol/L的醋酸緩沖液(pH 3.6)以體積比1∶1∶10混合，并在37℃下靜置1 h得FRAP工作液。

測(cè)定方法:將橄欖酚類粗提物和純化物分別稀釋成不同濃度(0.01、0.02、0.05、0.1 和 0.2 mg/mL)，以BHA和Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。精確吸取樣品稀釋液100 μL，加入 300 μL 超純水和 3 mL 新鮮配制的FRAP工作液，充分混合，在37℃反應(yīng)30 min后，于593 nm處測(cè)定吸光值，以超純水作為空白對(duì)照。以0～600 μmol/L的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的還原能力(FRAP值)以TEAC值表示［8］。

1.2.8 亞鐵離子螯合能力的測(cè)定

將橄欖酚類粗提物和純化物分別稀釋成不同濃度(0.01、0.02、0.05、0.1 和 0.2 mg/mL)，以 BHA 和Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。參照文獻(xiàn)［9］方法有所改進(jìn)，1 mL樣品溶液與0.05 mL的FeCl2溶液(2 mmol/L)、1.85 mL超純水混合。加入0.1 mL的ferrozine(5 mmol/L)溶液，并均勻混合。30℃條件下保溫10 min，在562 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)1。以超純水為空白對(duì)照得A0。計(jì)算螯合率。

2 結(jié)果與討論

2.1 橄欖提取物中總酚含量

經(jīng)Folin-Ciocalteu法測(cè)定，橄欖粗提物粉末中總酚含量為15.4%，純化物粉末中總多酚含量為49.7%。

2.2 橄欖酚類提取物ABTS+·清除能力

圖1 橄欖酚類提取物的ABTS+·清除能力

如圖1所示，橄欖酚類粗提物、純化物，BHA和Vc清除ABTS+·的能力均隨樣品濃度增大而增強(qiáng)，橄欖酚類粗提物和純化物ABTS+·清除能力在相同濃度下差別不大(P＞0.05)。在0.01～0.05 mg/mL內(nèi)，橄欖酚類粗提物和純化物的劑量-效應(yīng)關(guān)系增加很明顯，而在0.05～0.1 mg/mL內(nèi)清除能力增加比較平緩，在0.1 mg/mL時(shí)，其TEAC值分別為957.9 μmol/L(清除率為99.7%)和 959.4 μmol/L(清除率為99.8%)。在各濃度下，粗提物和純化物ABTS+·清除能力均顯著強(qiáng)于 BHA和 Vc(P＜0.05)。且BHA、Vc在0.1 mg/mL時(shí)其 TEAC值才分別達(dá)到754.8μmol/L(清除率為 79.5%) 和 391.6 μmol/L(清除率為43.5%)。由此顯示，橄欖酚類物質(zhì)具有很強(qiáng)的ABTS+·清除能力。

2.3 橄欖酚類提取物DPPH·清除能力

由圖2可知，在0.001～0.02 mg/mL內(nèi)，各樣品清除DPPH·的能力隨濃度增大而增強(qiáng)，且劑量－效應(yīng)現(xiàn)象非常明顯，清除能力從強(qiáng)到弱依次為橄欖酚類純化物，粗提物，Vc，BHA(P＜0.05)。在0.02 mg/mL時(shí)，粗提物、純化物和Vc清除DPPH·的TEAC值均接近最大值40μmol/L(清除率為95.5%)，之后清除能力變化較小。而B(niǎo)HA清除DPPH·能力相對(duì)較弱，在0.02 mg/mL時(shí)其 TEAC值為33.3μmol/L(清除率為79.7%)。由此可見(jiàn)，橄欖酚類提取物具有較強(qiáng)的DPPH·清除能力，且粗提物和純化物在相同濃度條件下·OH清除能力相當(dāng)(P＞0.05)。

圖2 橄欖酚類提取物的DPPH·清除能力

2.4 橄欖酚類提取物·OH清除能力

從圖3可發(fā)現(xiàn)，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，橄欖酚類粗提物、純化物，BHA清除·OH的能力隨樣品濃度增大而逐漸增強(qiáng)，清除率從30%左右增加到最大的50%左右。而Vc的·OH清除能力則明顯很弱，其清除率均在6%以下。濃度在0.05 mg/mL以下時(shí)，橄欖酚類提取物的·OH清除能力與BHA無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，但在0.1 mg/mL以上時(shí)，提取物·OH清除率要高于BHA。說(shuō)明橄欖酚類提取物具有一定的·OH清除能力。另外，橄欖酚類粗提物和純化物在相同濃度條件下其·OH清除能力相差不大(P＞0.05)。

圖3 橄欖酚類提取物的·OH清除能力

2.5 橄欖酚類提取物清除能力

圖4 橄欖酚類提取物的清除能力

2.6 橄欖酚類提取物鐵離子還原能力

如圖5所示，在試驗(yàn)濃度內(nèi)，橄欖酚類粗提物、純化物和BHA的鐵離子還原能力均隨樣品濃度增大而明顯增加(P＜0.05)，在0.2 mg/mL時(shí)，酚類提取物的FRAP值達(dá)1 700μmol/L Trolox以上，而Vc的鐵離子還原能力則相對(duì)較弱(700μmol/L Trolox)。在相同濃度條件下，橄欖酚類提取物的鐵離子還原能力要強(qiáng)于BHA和Vc，說(shuō)明橄欖酚類提取物具有較強(qiáng)的還原能力，其總抗氧化活性較強(qiáng)。另外，橄欖酚類粗提物和純化物的鐵離子還原力差異較小(P＞0.05)。

圖5 橄欖酚類提取物的鐵離子還原能力

2.7 橄欖酚類提取物金屬離子螯合能力

橄欖酚類提取物和Vc的亞鐵離子螯合能力均較弱，BHA在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)顯示無(wú)亞鐵離子螯合能力(見(jiàn)圖6)。酚類純化物金屬離子螯合能力隨樣品濃度增大而有所增強(qiáng)(P＜0.05)，其濃度在0.2 mg/mL時(shí)，螯合率為14.9%。Vc的金屬離子螯合率最高為15.8%，隨濃度增大其螯合率減小并維持在5%左右的水平。而橄欖酚類粗提物的亞鐵離子螯合率均在4%以下，明顯低于橄欖酚類純化物(P＜0.05)，這可能是由于不同純度的酚類提取物中酚類化合物組成不同所致。

圖6 橄欖酚類提取物的金屬離子螯合能力

3 結(jié)論

對(duì)橄欖酚類提取物進(jìn)行不同的抗氧化體系檢測(cè)，結(jié)果表明，橄欖酚類提取物具有比BHA和Vc更強(qiáng)的ABTS+·、DPPH·和·OH清除能力及鐵離子還原力，橄欖酚類提取物同時(shí)具有較好的O2－·清除能力，雖不及Vc，但強(qiáng)于BHA，而其亞鐵離子螯合能力較弱。橄欖酚類粗提物和純化物相同濃度下在ABTS+·、DPPH·、·OH清除能力和鐵離子還原能力方面相差不大(P＞0.05)，而在O2－·清除能力和亞鐵離子螯合能力方面表現(xiàn)有所差異，純化物亞鐵離子螯合能力要強(qiáng)于粗提物，其O2－·清除能力要弱于粗提物。綜合而言，橄欖酚類提取物顯示具有較好的抗氧化性能，可作為天然抗氧化劑進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

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