施碧紅，李強(qiáng)，陳明，吳偉斌，施巧琴，吳松剛

1(福建師范大學(xué)教育部工業(yè)微生物工程研究中心，福建福州，350108)2(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州，350108)

微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的一個(gè)重要來源。工業(yè)催化上要求脂肪酶具有高的活性、穩(wěn)定性以及對(duì)底物的特異性。擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)FS1884所產(chǎn)堿性脂肪酶是國(guó)產(chǎn)商品化的堿性脂肪酶制劑，已被用于洗滌、面包加工、皮革脫脂、魚類脫脂等領(lǐng)域。但實(shí)際應(yīng)用中仍需進(jìn)一步提高該脂肪酶的熱穩(wěn)定性和酶活力。擴(kuò)展青霉FS1884是經(jīng)過20多代物理化學(xué)誘變后的高產(chǎn)突變株，對(duì)各種物理化學(xué)誘變劑已產(chǎn)生一定的飽和效應(yīng)，用傳統(tǒng)的誘變技術(shù)進(jìn)一步改善其所產(chǎn)脂肪酶的性質(zhì)或提高酶活已出現(xiàn)困難。且傳統(tǒng)的誘變育種方法具有篩選工作量大、突變體遺傳背景不清楚等缺點(diǎn)。易錯(cuò)PCR(error-prone PCR)技術(shù)直接對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的編碼序列進(jìn)行隨機(jī)突變，進(jìn)而定向篩選理想性狀的蛋白質(zhì)，為改良目標(biāo)蛋白及解析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供快捷途徑。大腸桿菌中，高絲氨酸－琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(MetA)是甲硫氨酸合成途徑中第1個(gè)關(guān)鍵酶，該酶使其無(wú)法適應(yīng)高溫的生長(zhǎng)環(huán)境，Mordukhova［1］通過易錯(cuò) PCR 技術(shù)，篩選到了1株MetA的突變株，其中有5個(gè)氨基酸發(fā)生了突變:S61T，E213V，I229T，N267D和 N271K，使其能在更高的溫度下(44℃)生長(zhǎng)。Niu［2］等通過定向進(jìn)化(易錯(cuò)PCR和DNA Shuffling結(jié)合)的研究方法，建立Rhizopus arrhizus脂肪酶隨機(jī)突變文庫(kù)，篩選到1株最適作用溫度提高10℃的突變株，且突變株在50℃下的半衰期比野生型脂肪酶提高了12倍。Kim［3］通過易錯(cuò)PCR和重疊延伸PCR結(jié)合的方法，篩選到了1株突變體，在50℃和55℃放置2h后殘余活力分別為30%和10%，而野生型在此條件下均失去活性，突變體的耐熱性大大提高。

本研究利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)擴(kuò)展青霉脂肪酶基因進(jìn)行隨機(jī)突變，建立隨機(jī)突變文庫(kù)，通過高通量篩選，期望獲得脂肪酶耐熱性和酶活力都有所提高的突變株。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

Pichia pastorisGS115、pPIC3.5K，由福建師范大學(xué)林琳教授提供，E.coliJM109由本實(shí)驗(yàn)室保存。pPIC3.5k-PEL為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存［4］，PEL為Penicillium expansumlipase的縮寫(下同)。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB、YPD、MD、BMGY、BMMY、MM 均根據(jù) invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit說明配制，OMM平板為MM平板加上2.5%橄欖油乳化液，橄欖油檢驗(yàn)板為含有2.5%橄欖油乳化液的瓊脂板。

1.1.3 引物

引物P1，P2用于從pPIC3.5K-PEL質(zhì)粒上擴(kuò)增脂肪酶(PEL)基因，其設(shè)計(jì)原理見參考文獻(xiàn)［4］:

P3:5＇GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3＇(5’AOX引物)

P4:5＇GGCAAATGGCATTCTGACATCCT 3＇(3’AOX引物)

1.2 方法

1.2.1 脂肪酶隨機(jī)突變庫(kù)的建立

以含擴(kuò)展青霉脂肪酶基因的pPIC3.5k-PEL質(zhì)粒DNA為摸板，P1，P2為引物進(jìn)行易錯(cuò) PCR。100μL PCR 體系如下:10 ×PCR Buffer 10 μL，dATP(100 mmol/L)0.2μL，dGTP(100 mmol/L)0.2μL，dCTP(100 mmol/L)1μL，dTTP(100 mmol/L)1μL，MgCl2(25 mmol/L)20 μL ，MnCl2(10 mmol/L)1 μL ，P1Primer(10 μmol/L)1 μL，P2Primer(10μmol/L)1μL，大量抽提 pPIC3.5k-PEL 質(zhì)粒 DNA 1μL ，TaqDNA Polymerase 2 U，再加入滅菌超純水到100 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃ 2 min;30×(94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min);72℃ 7 min。

PCR擴(kuò)增的突變產(chǎn)物用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，與經(jīng)相同雙酶切的pPIC3.5k連接，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC3.5k-PEL-Mut，，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109，構(gòu)建突變體庫(kù)。

1.2.2 突變文庫(kù)的篩選

大量抽提突變體庫(kù)質(zhì)粒，經(jīng)SalⅠ線性化后電轉(zhuǎn)畢赤酵母GS115，涂布于MD平板上，用無(wú)菌牙簽挑選轉(zhuǎn)化子到含有1%橄欖油乳化液的OMM平板上進(jìn)行初篩。OMM平板含有0.5%的甲醇，可誘導(dǎo)pPIC3.5K上的AOX啟動(dòng)子，啟動(dòng)脂肪酶的表達(dá)，水解橄欖油乳化液后形成水解圈。以含有野生型脂肪酶基因的畢赤酵母GS115(PEL-GS)為對(duì)照進(jìn)行初篩，選擇在OMM平板上產(chǎn)生比野生型脂肪酶透明圈大的菌落，進(jìn)行復(fù)篩。

將初篩獲得的各菌株分別接種1 mL BMMY液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖管發(fā)酵，30℃振蕩培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)液經(jīng)過離心后，平板檢測(cè)酶的活性，耐熱性，耐酸性等，篩選優(yōu)良突變株，搖管復(fù)篩中以PEL-GS115為對(duì)照。

將搖管復(fù)篩獲得的優(yōu)良突變菌株在含甲醇的BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)脂肪酶，測(cè)定脂肪酶活性和耐熱性以及最適作用溫度等。

1.2.3 表達(dá)產(chǎn)物鑒定

平板透明圈法檢測(cè)脂肪酶活性，在pH9.4的緩沖液中加入2%瓊脂粉，并加入2.5%的橄欖油乳化液，制成檢驗(yàn)板，用打孔器打孔，每孔加入發(fā)酵液10 μL，37℃放置24 h，觀察產(chǎn)生的水解圈的大小。

1.2.4 脂肪酶活性的測(cè)定

以橄欖油為底物，采用NaOH滴定法［5］測(cè)定酶活力。

1.2.5 突變脂肪酶最適作用溫度

以橄欖油為底物，在 30、35、40、45、50℃下，采用NaOH滴定法分別測(cè)定PEL-GS(野生重組酶)和突變體脂肪酶(ep3-GS)的酶活，以相對(duì)酶活確定突變酶的最適作用溫度，與對(duì)照相比，觀察酶活性的提高程度。

1.2.6 突變脂肪酶熱穩(wěn)定性

分別將野生重組酶PEL-GS和突變體脂肪酶在30，35，40，45，50℃ 溫育 30 min 后，迅速置冰浴 30 min，在pH9.4，35℃測(cè)定酶的殘余活力。以未經(jīng)溫度處理的酶液的酶活力為100%，換算不同溫度處理后的殘余酶活百分比，制作對(duì)溫度的變化曲線，確定酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.7 突變酶的適宜反應(yīng)pH值

在不同pH的橄欖油平板上，采用透明圈法分別測(cè)定突變脂肪酶與野生脂肪酶的酶活力。其中pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0橄欖油乳化平板由 K2HPO4-KH2PO4緩沖體系配制，pH 9.4及 pH 10.0橄欖油平板由甘氨酸-NaOH緩沖體系配制。分別以突變酶及野生酶的最大脂肪酶活力為100%，換算相對(duì)酶活力，以相對(duì)酶活對(duì)反應(yīng)pH值作圖，確定突變脂肪酶及野生重組酶的適宜pH值。

1.2.8 正向突變株堿性脂肪酶基因的序列測(cè)定、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和突變位點(diǎn)分析

提取高酶活的畢赤酵母突變菌株的基因組DNA［6－7］，PCR 擴(kuò)增及酶切驗(yàn)證突變脂肪酶基因 cDNA，由invitrogen公司進(jìn)行脂肪酶基因的序列測(cè)定。在SWISSMODEL數(shù)據(jù)庫(kù)輸入突變蛋白的氨基酸序列，預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，分析位點(diǎn)突變效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變脂肪酶基因的獲得及突變文庫(kù)的構(gòu)建

使用P1、P2為引物在優(yōu)化后的易錯(cuò)PCR條件下擴(kuò)增擴(kuò)展青霉脂肪酶cDNA片段，易錯(cuò)PCR產(chǎn)物如圖1，條帶大小為900bp左右，符合預(yù)期大小。經(jīng)純化并雙酶切的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物，與pPIC3.5k載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，得到了約104個(gè)轉(zhuǎn)化子的突變文庫(kù)。

2.2 突變文庫(kù)的篩選

將文庫(kù)的轉(zhuǎn)化子經(jīng) LB液體培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，涂布在MD平板，經(jīng)過初篩，篩選了大約4 000株轉(zhuǎn)化了含有目的突變基因的畢赤酵母(圖2)，其中選擇了約300株進(jìn)行小量的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過72 h的誘導(dǎo)，脂肪酶在畢赤酵母中得到成功表達(dá)。分別取10 μL發(fā)酵上清液在3種不同條件的檢驗(yàn)板進(jìn)行酶活測(cè)定篩選，篩選1株優(yōu)良突變株ep3。該突變株在橄欖油平板上透明圈達(dá)到2.2 cm。

圖1 易錯(cuò)PCR產(chǎn)物效果圖

圖2 突變株在含橄欖油平板上的篩選

2.3 突變脂肪酶的性質(zhì)

對(duì)突變株ep3產(chǎn)生的脂肪酶ep3-GS和野生型重組酶的表達(dá)產(chǎn)物(PEL-GS)進(jìn)行不同溫度下酶活測(cè)定，發(fā)現(xiàn)突變酶的最適作用溫度與野生重組酶一致，均為35℃ (圖3)，35℃時(shí)突變酶ep3-GS的活力為3 440 U/mg，比該溫度下野生型重組脂肪酶PEL-GS的酶活提高了17%;突變酶及野生重組酶的表達(dá)量分別為0.7、0.6 mg/mL。溫度對(duì)突變脂肪酶的影響顯著，50℃時(shí)突變酶的活性僅為最適反應(yīng)溫度(35℃)下酶活的30%。

圖3 ep3-GS與PEL-GS的最適作用溫度

將野生型PEL-GS與突變體脂肪酶ep3-GS分別在不同溫度放置30 min，測(cè)其殘余酶活，結(jié)果顯示，突變體脂肪酶的熱穩(wěn)定性相比于野生型的脂肪酶有了一定的改善，突變體脂肪酶45℃放置0.5h殘余34%的活力，40℃放置0.5 h殘余52%的活力，均高于野生型酶的耐熱性(圖4)。

圖4 突變體脂肪酶與野生型脂肪酶的耐熱性

對(duì)突變脂肪酶ep3-GS和野生型重組酶PEL-GS在不同pH值的橄欖油平板上進(jìn)行酶活測(cè)定，發(fā)現(xiàn)突變酶的最適pH值沒有發(fā)生明顯變化，與野生重組酶一致，為pH9.4(圖5)。

圖5 突變體脂肪酶與野生型脂肪酶的最適pH

2.4 突變脂肪酶基因的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與突變位點(diǎn)的檢測(cè)

利用SWISSMODEL REPOSITORY對(duì)突變脂肪酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)突變脂肪酶ep3-GS的三級(jí)結(jié)構(gòu)與野生型脂肪酶PEL-GS無(wú)明顯差異。測(cè)序結(jié)果顯示，脂肪酶基因的424位堿基發(fā)生突變，即A424G。突變脂肪酶一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生一個(gè)氨基酸的變化，142位上的氨基酸由堿性氨基酸賴氨酸突變成酸性氨基酸谷氨酸(LYS142GLU)。

3 討論

本研究利用易錯(cuò)PCR的隨機(jī)突變能力，簡(jiǎn)單快速地在擴(kuò)展青霉堿性脂肪酶基因上制造核苷酸變化，通過調(diào)節(jié)易錯(cuò)PCR體系中Mn2+的濃度，調(diào)控堿基突變率，使氨基酸突變率穩(wěn)定在每個(gè)基因1～2個(gè)的范圍內(nèi)［8］，獲得了脂肪酶突變基因群，構(gòu)建擴(kuò)展青霉堿性脂肪酶基因突變文庫(kù)。同時(shí)利用脂肪酶對(duì)橄欖油的水解能力，建立了簡(jiǎn)單、快捷、經(jīng)濟(jì)的高通量平板篩選方法。在含橄欖油底物的各種平板上，直接觀察菌落周圍或酶液周圍的水解圈大小，直觀、高效地挑選不同條件下水解能力強(qiáng)的突變株。多個(gè)突變體篩選同時(shí)進(jìn)行，提高了篩選效率。

擴(kuò)展青霉堿性脂肪酶屬于α/β型水解酶，含285個(gè)氨基酸，其中前27個(gè)氨基酸為信號(hào)肽和前肽，其余258個(gè)氨基酸組成成熟肽［9］。擴(kuò)展青霉脂肪酶的活性中心是由高度保守的Ser-Asp-His組成的催化三聯(lián)體，包埋在脂肪酶空間結(jié)構(gòu)中央的β-折疊的環(huán)中，形成疏水環(huán)境?；钚灾行耐庥幸欢桅谅菪纬傻纳w子，在非激活狀態(tài)下掩蓋催化中心，起保護(hù)作用。脂肪酶被激活時(shí)，這個(gè)蓋子就打開，暴露活性中心［9－11］。測(cè)序結(jié)果顯示，142位的賴氨酸突變?yōu)楣劝彼?Lys142Glu)，由堿性氨基酸變?yōu)樗嵝园被幔诳臻g結(jié)構(gòu)上，該氨基酸位于脂肪酶結(jié)構(gòu)的第4個(gè)α螺旋上，該α螺旋緊靠第2個(gè)β折疊，142位的賴氨酸突變?yōu)樗嵝缘墓劝彼幔劝彼峥膳c空間位置上靠近的堿性氨基酸形成鹽橋，如與第2個(gè)β折疊上63位的賴氨酸形成鹽橋，鹽橋的形成可能對(duì)α螺旋的構(gòu)象翻轉(zhuǎn)起到支持作用，因而促進(jìn)脂肪酶水解能力提高。

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