朱飛舟,陳利玉,劉新發(fā),田 奇,談 成,歐陽方丹,吳正理＊,陳漢春＊

(1.中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)系,湖南長沙 410013;2.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物學(xué)系,湖南長沙 410013;3.中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)中心,湖南長沙 410013)

病原菌引起的感染性、傳染性疾病是威脅人類健康和導(dǎo)致社會恐慌的重要因素,快速準(zhǔn)確地檢測病原菌是有效預(yù)防和治療這類疾病的關(guān)鍵。常規(guī)的生理生化、血清學(xué)鑒定方法操作繁瑣、周期長,而且某些病原菌培養(yǎng)困難。PCR、EL ISA等方法雖然縮短了檢測周期,但假陽性率高[1-2]?；蛐酒?gene chip)技術(shù)的興起,使快速、微量、準(zhǔn)確、高通量地檢測病原菌成為可能[3]。基因芯片檢測病原菌選取的靶基因一般為16S rRNA和23S rRNA基因及16S～23S rRNA基因間隔區(qū)等[4],標(biāo)記基因的方法有Cy3或Cy5等熒光染料、生物素、地高辛等[4-5]。目前應(yīng)用的病原菌檢測芯片多采用熒光標(biāo)記,操作中需要激光共聚焦微陣列掃描儀、基因芯片點(diǎn)樣儀等貴重儀器[6]。本研究選取細(xì)菌16S rRNA基因?yàn)闄z測靶點(diǎn)并設(shè)計(jì)探針,硝酸纖維素薄膜條作為固定探針的基質(zhì),利用生物素標(biāo)記16S rRNA基因PCR擴(kuò)增片段,然后雜交和檢測,建立了一種高通量、低成本、快速、準(zhǔn)確的細(xì)菌檢測方法。該方法具有良好的臨床應(yīng)用前景,對感染性、傳染性疾病的預(yù)防、診斷、治療具有重要的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

10種細(xì)菌:大腸埃希菌,腸道沙門菌,粘質(zhì)沙雷菌,陰溝腸桿菌,奇異變形桿菌,銅綠假單胞菌,鮑曼不動桿菌,枯草芽胞桿菌,溶血性葡萄球菌,金黃色葡萄球菌由中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物學(xué)系保存。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組DNA提取 ①CTAB法提取細(xì)菌基因組DNA:接種菌株于LB液體培養(yǎng)基,37℃震蕩培養(yǎng)過夜,取1.5 mL培養(yǎng)物于12 000 r/min離心2 min。去上清液,加入567μL的TE緩沖液,震蕩重新懸浮細(xì)菌。然后,加入30μL 10%SDS和15μL 20 mg/mL蛋白酶K(革蘭陽性菌需先加入20μL 10 mg/mL溶菌酶,37℃反應(yīng)15 min后再加入蛋白酶K),混勻,于37℃溫育1 h,其間多次顛倒混勻。溶液變澄清則表示細(xì)菌裂解完全。隨后,加入100μL 5 mol/L NaCl和80μL CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide,十六烷基三甲基溴化銨)/NaCl溶液(5 g CTAB溶于100 mL 0.5 mol/L NaCl溶液中,加熱至65℃使之溶解后室溫保存),混勻,65℃溫育10 min,可見白色沉淀。然后加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25◇24◇1),混勻至乳濁狀。12 000 r/min離心5 min,轉(zhuǎn)上清液至一潔凈試管,加入與上清液等體積的異丙醇,輕輕混勻,直至產(chǎn)生絮狀DNA沉淀。12 000 r/min離心5 min,去上清液,沉淀用1 mL的70%乙醇洗滌。離心,棄乙醇,在潔凈工作臺中干燥沉淀。最后,將沉淀溶于50μL TE緩沖液,加入1μL RNase A(10 mg/mL),4℃保存?zhèn)溆?②丙酮直接煮沸法:取細(xì)菌懸液,加入等體積丙酮,置于沸水浴中煮沸10 min。然后12 000 r/min離心2 min,其上清液即為細(xì)菌DNA溶液,可以作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.2.2 PCR擴(kuò)增16S rRNA基因片段 引物合成和生物素標(biāo)記由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。建立50μL PCR反應(yīng)體系:DNA模板1μL,ddH2O 38.5μL,10×PCR緩沖液5μL,25 mmol/L MgCl22μL,10 mmol/L dNTP 1μL,20 μmol/L引物(1)1μL,20μmol/L引物(2)1μL,5 U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL。采用PTC-100 Peltier Ther malCycler(B IO-RAD)進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)程序?yàn)?4℃變性5 min后于94℃變性45 s、55℃退火45 s、72℃延伸90 s,30個(gè)循環(huán)后于72℃延伸7 min。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR產(chǎn)物序列分析 引物27F和1492R對細(xì)菌16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物正反測序,由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.2.4 序列同源性比對 根據(jù)測序所得的10種細(xì)菌16S rRNA基因片段的序列圖,去掉兩端的不規(guī)則峰,取中間1 380 bp片段序列進(jìn)行同源性分析。如果要鑒定細(xì)菌,則將序列導(dǎo)入美國NCB I網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的blastn在線軟件,選擇Nucleotide collection(nr/nt)數(shù)據(jù)庫,然后運(yùn)行blastn程序,取16S rRNA基因序列同源性最高的細(xì)菌作為鑒定的結(jié)果。如果要比對10種病原細(xì)菌16S rRNA基因序列的同源性,則將它們的序列導(dǎo)入ClustalX(1.86)軟件,然后在菜單中選擇Alignment→Do Complete Alignment,即得10種細(xì)菌的16S rRNA基因序列同源性比對圖。

1.2.5 基因檢測膜條的制備 根據(jù)10種病原細(xì)菌16S rRNA基因序列比對的結(jié)果,在引物對250F/Bio-1020R擴(kuò)增的770 bp片段內(nèi),尋找序列多態(tài)性位點(diǎn),并以該位點(diǎn)的正向序列設(shè)計(jì)探針,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將探針按圖5的布局點(diǎn)在硝酸纖維素膜上,80℃烤膜1～2 h,使探針與膜牢固結(jié)合,即得10種病原細(xì)菌的基因檢測膜條。

1.2.6 核酸分子雜交 以細(xì)菌DNA為模板,用引物對250F/Bio-1020R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到生物素標(biāo)記的16S rRNA基因770 bp片段。將該P(yáng)CR產(chǎn)物100℃水浴變性5 min,冰浴驟冷?；驒z測膜條經(jīng)預(yù)雜交后,向雜交液中加入變

性的生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物,雜交1 h,洗膜。然后,封閉30 min,SA-AP(streptavidin labled by alkaline phosphatase,堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈親和素)(1◇1 000稀釋)結(jié)合30 min,洗膜,NBT(nitroblue tetrazolium,硝基四氮唑藍(lán))/BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate,5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸)顯色。肉眼觀察,Gel DocTMXR+ Imaging System(B IO-RAD)照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA基因序列分析法鑒定細(xì)菌

為確定這10種細(xì)菌,在制備基因檢測膜條之前采用16S rRNA基因序列分析法對這10種細(xì)菌進(jìn)行鑒定。采用CTAB法或丙酮直接煮沸法提取細(xì)菌基因組DNA。結(jié)果表明,CTAB法和丙酮直接煮沸法提取的DNA均可作為PCR擴(kuò)增的模板,但丙酮直接煮沸法快速、簡單,更適于臨床應(yīng)用。27F和1492R引物的通用性好,可以擴(kuò)增10種細(xì)菌的16S rRNA基因片段,擴(kuò)增片段大小為1 450 bp左右(圖1)。以擴(kuò)增片段為模板,引物27F和1492R正反測序,然后根據(jù)序列的同源性對細(xì)菌進(jìn)行鑒定,同源性最高的細(xì)菌即為鑒定的結(jié)果。以金黃色葡萄球菌鑒定為例進(jìn)行說明。取測序所得的金黃色葡萄球菌16S rRNA基因1 380 bp片段的序列,在線軟件blastn中比對后,選擇Taxonomy reports,即可得到具有同源序列的細(xì)菌,以同源性從高到低的順序從上往下排列,序列同源性最高的細(xì)菌就是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(圖2)。10種細(xì)菌鑒定的結(jié)果見表1。

2.2 設(shè)計(jì)10種細(xì)菌的通用引物和探針

為設(shè)計(jì)通用引物和探針,將10種細(xì)菌16S rRNA基因片段序列進(jìn)行比對,尋找16S rRNA基因中的序列保守區(qū)和多態(tài)區(qū)(圖3)。利用保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物250F和bio-1020R(表2),利用多態(tài)區(qū)設(shè)計(jì)探針。

2.3 膜條檢測10種細(xì)菌

將10種細(xì)菌的16S rRNA基因片段進(jìn)行體外擴(kuò)增,并在擴(kuò)增的同時(shí)將擴(kuò)增片段進(jìn)行生物素標(biāo)記。以細(xì)菌的基因組DNA為模板,通用引物250F、bio-1020R可以擴(kuò)增10種細(xì)菌的16S rRNA基因片段,長度在770 bp左右(圖4A)。隨后,檢測反向引物bio-1020R生物素標(biāo)記是否成功,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1020R(沒有生物素標(biāo)記、但序列與bio-1020R完全相同的引物)經(jīng)檢測沒有信號,而bio-1020R經(jīng)檢測有很強(qiáng)的信號,說明生物素已經(jīng)成功標(biāo)記在bio-1020R引物的5′端(圖4B)。這也說明擴(kuò)增得到的16S rRNA基因片段已經(jīng)被生物素標(biāo)記,可以用于后續(xù)的核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)。

圖2 金黃色葡萄球菌16S rRNA基因片段序列在Nucleotide數(shù)據(jù)庫中比對的結(jié)果Fig.2 Aligning 16S rRNA gene fragment sequence ofStaphylococcusaureus in Nucleotide database

圖3 10種細(xì)菌16S rRNA基因序列比對Fig.3 Alignment of 16S rRNA gene fragment sequences of 10 species of bacteria

圖4 用于核酸分子雜交的16S rRNA基因片段擴(kuò)增Fig.4 Amplifying 16S rRNA gene fragments used in DNA hybridization

表1 16S rRNA基因序列分析法鑒定細(xì)菌的結(jié)果Table 1 Identification of bacteria by 16S rRNA gene sequence analysis

表2 16S rRNA基因片段擴(kuò)增引物Table 2 Primer sequences for amplifying 16S rRNA gene fragments

用擴(kuò)增的10種細(xì)菌的16S rRNA基因片段分別與膜條進(jìn)行雜交,檢測膜條的特異性和有效性。用膜條分別與10種細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增片段雜交,結(jié)果發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)相對應(yīng)的、特異性的信號,而無序的核酸探針均沒有信號,細(xì)菌通用探針均出現(xiàn)信號(圖6A～J)。這說明該膜條能特異地、有效地檢測這10種細(xì)菌。同時(shí)擴(kuò)增大腸埃希菌、腸道沙門菌、粘質(zhì)沙雷菌、鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌5種細(xì)菌的16S rRNA基因片段,并與膜條雜交,結(jié)果發(fā)現(xiàn)5種菌的探針均出現(xiàn)信號,說明該膜條可以同時(shí)檢測出這5種細(xì)菌(圖6K)。

圖5 10種細(xì)菌檢測膜條的探針排列順序Fig.5 Array of probes for 10 species of bacteria in the membranous oligonucleotide chip

圖6 膜條檢測10種細(xì)菌Fig.6 Detection of 10 species of bacteria by the membranous oligonucleotide chip

3 討 論

目前,病原菌的常規(guī)檢測主要采用細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定和血清學(xué)抗原抗體檢測等傳統(tǒng)方法。這些方法操作繁瑣、周期長、通常報(bào)告結(jié)果需要3～5 d,而且某些病原菌培養(yǎng)困難。近年來也發(fā)展了PCR、EL ISA等技術(shù),但無法滿足一次檢測多樣本和多種病原體的需求,且假陽性率較高[1-2]?；蛐酒侵笇⒃S多特定的DNA片段作為探針有序地緊密排列并固定在固相支持物上,然后與待測的標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交,雜交后進(jìn)行檢測和比較分析。該技術(shù)自20世紀(jì)末出現(xiàn)以來,已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域,如基因表達(dá)分析、基因突變檢測、基因診斷、新基因發(fā)現(xiàn)等。在病原菌檢測方面,基因芯片以快速、微量、準(zhǔn)確、高通量的特點(diǎn),迅速得到廣泛應(yīng)用[7-9]。

與傳統(tǒng)病原菌檢測方法相比,本研究建立的膜條雜交法的優(yōu)勢在于:1、高度靈敏性。可以直接檢測臨床樣本中的病原菌,無需培養(yǎng)。第一步是PCR,可以直接以臨床樣本中病原菌的微量DNA為模板,擴(kuò)增16S rRNA基因片段;2、高準(zhǔn)確性。膜條能特異有效地檢測10種細(xì)菌中的任何一種,準(zhǔn)確性高,不存在交叉反應(yīng)。3、高通量。1張膜條可以同時(shí)檢測多種病原菌,且DNA提取、PCR、雜交、檢測均可多個(gè)樣本同時(shí)進(jìn)行。4、快速。全部流程在1個(gè)工作日內(nèi)即可完成。

在基因芯片技術(shù)中,標(biāo)記基因的方法有Cy3或Cy5等熒光染料、生物素、地高辛等[4-5,10],基質(zhì)有玻片、硝酸纖維素薄膜、尼龍膜等[11-12]。最近,在病原菌的基因芯片檢測技術(shù)中涌現(xiàn)出一些新方法,如96微孔板DNA診斷芯片[13]、Lab-on-achip[14]。96微孔板DNA診斷芯片,即將多個(gè)病原菌的檢測探針點(diǎn)在96孔板的1個(gè)孔中。Labon-a-chip就是將樣品制備、PCR、雜交等操作流程集中在1塊板上,1次即可完成所有的程序。

本研究選用硝酸纖維素薄膜條作為固定探針的基質(zhì),采用生物素標(biāo)記細(xì)菌16S rRNA基因的擴(kuò)增片段,SA-AP檢測生物素標(biāo)記,然后NBT/BCIP顯色,建立了一種快速、準(zhǔn)確、低成本的細(xì)菌檢測方法。與其他基因芯片方法相比,本方法具有成本低、無需特殊設(shè)備、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)。

本研究選用10種常見細(xì)菌為研究材料,目的是建立用膜條檢測樣本中病原菌的方法。在此基礎(chǔ)上可開發(fā)感染性疾病和/或病原菌及支原體、病毒等鑒別診斷膜條。本方法將為促進(jìn)生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展作出積極的貢獻(xiàn)。

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