潘 欣,曾思良,蔡家麟,吳鑒今,楊 光,黃通來

(第二軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室,上海 200433)

土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)最早于1911年在美國加利福尼亞的圖萊里縣(Tulare County)暴發(fā)的鼠疫樣疾病的地松鼠(ground squirrel)中分離出來[1]。20世紀(jì)30年代和40年代由于大規(guī)模的水路運(yùn)輸,該病在歐洲、前蘇聯(lián)和美國流行,因該病最常見于野兔中,也稱野兔熱(rabbit fever)[2]。土拉弗朗西斯菌包括4個(gè)確認(rèn)的亞種:土拉熱(tularensis)亞種(A型)、全北區(qū)(holarctica)亞種(B型)、中亞細(xì)亞(mediasiatica)亞種和新兇手(novicida)亞種。其他從環(huán)境中檢測到的亞種尚未成功分離培養(yǎng)。A型菌株(高致病性)幾乎專屬于北美,而B型分布在整個(gè)北半球溫帶地區(qū),相對(duì)弱毒,未治療的皮膚感染死亡率低于0.5%[3]。我國自1957年首次在內(nèi)蒙通遼地區(qū)從黃鼠體內(nèi)首次分出土拉弗朗西斯菌后,在黑龍江、青海、西藏、新疆等地又從人、野兔、硬蜱中相繼分離出該菌。西藏阿里地區(qū)已證實(shí)為土拉弗朗西斯菌病的自然疫源地[4]。土拉弗朗西斯菌為革蘭陰性、不運(yùn)動(dòng)、不形成芽胞的需氧球桿菌,該菌采取有效的方式侵入宿主細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)增殖,在侵入以及在宿主細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸內(nèi)化期間,曾觀察到巨噬細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)域中的窖蛋白涉及土拉弗朗西斯菌的早期入侵[5]。最近的研究發(fā)現(xiàn)土拉弗朗西斯菌感染巨噬細(xì)胞15～30 min,可查見脂筏相關(guān)成分如膽固醇和神經(jīng)節(jié)苷脂G M1涉及土拉弗朗西斯菌侵入胞內(nèi),肌動(dòng)蛋白與膽固醇結(jié)合為巨噬細(xì)胞攝入細(xì)菌提供動(dòng)力;感染60 min以后,脂筏難以查見,但可觀察到肌動(dòng)蛋白富集在細(xì)菌周圍,可能與細(xì)菌在胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)或胞間感染有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞系和質(zhì)粒 土拉弗朗西斯菌全北區(qū)亞種LVS(Francisella tularensissubsp.holarctica LVS,以下簡稱FTLVS)及表達(dá)綠色熒光蛋白的FTLVS-GFP菌株為本室保存[5]。表達(dá)6-磷酸甘露糖受體的J774A.1細(xì)胞購于ATCC。

1.1.2 培養(yǎng)條件 細(xì)菌用含有IsoVitaleX(BD Biosciences)的巧克力Ⅱ瓊脂平板于37℃培養(yǎng)72 h[6]。完全細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM(Sigma)中補(bǔ)充了10%胎牛血清(HyClone,未進(jìn)行熱滅活)?；罹僮髟谏锇踩?jí)實(shí)驗(yàn)室完成[7]。

1.2 方法

1.2.1 土拉弗朗西斯菌LVS感染巨噬細(xì)胞 用一次性接種環(huán)挑取數(shù)個(gè)土拉弗朗西斯菌LVS克隆懸浮于含10%FBS的DMEM中。5 000 r/min離心10 min。細(xì)菌沉淀用含10%FBS的DMEM洗2次,再重懸于含10%FBS的DMEM中。用OD600/克隆形成單位標(biāo)準(zhǔn)曲線將感染復(fù)數(shù)調(diào)整為50。J774A.1細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)18 h。細(xì)胞用暖的完全細(xì)胞培養(yǎng)基洗2次。在細(xì)胞單層中加入MO I為50的用相應(yīng)培養(yǎng)基懸浮的細(xì)菌,1 000 r/min室溫離心5 min,然后37℃下在5%CO2中放置60 min,用暖的完全細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌3次,換含10μg/mL慶大霉素的完全細(xì)胞培養(yǎng)基作用30 min,暖的完全細(xì)胞培養(yǎng)基洗2次,換不含慶大霉素的完全細(xì)胞培養(yǎng)基,37℃下在5%CO2中培養(yǎng)至指定時(shí)間點(diǎn)。

1.2.2 免疫熒光染色 J774A.1接種于培養(yǎng)皿的無菌蓋玻片上,細(xì)胞感染MO I為50的FTLVSGFP,在給定時(shí)間內(nèi)用4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗,用含0.5%Triton X-100的PBS透化30 min,PBS洗,用 Image-iT FX信號(hào)增強(qiáng)劑(Invitrogen)封閉30 min,成為固定片。用PBS將霍亂毒素B亞基(cholera toxin B,CTB)(Invitrogen)稀釋至1μg/mL,于4℃與固定片孵育10 min,PBS洗。CTB能與脂筏中的神經(jīng)節(jié)苷脂G M1特異結(jié)合,觸發(fā)胞膜窖介導(dǎo)(caveolae-mediated)的毒素內(nèi)化[8]。用PBS將鍵合了Alexa 594的兔抗霍亂毒素B亞基IgG(Invitrogen)按1◇200稀釋,室溫顯色15 min。PBS洗后,過一遍雙蒸水,晾干。蓋玻片用抗褪色金牌介質(zhì)(Invitrogen)在載玻片上裝片。J774A.1接種于培養(yǎng)皿的無菌蓋玻片上,細(xì)胞感染MO I為50的FTLVS-GFP,培養(yǎng)皿中同時(shí)加入終濃度為5μg/mL菲律平Ⅲ(filipin III)(Sigma)。菲律平Ⅲ是一種結(jié)合膽固醇的制劑,插入細(xì)胞膜后顯示藍(lán)色熒光[9]。感染60 min后制成固定片。鍵合了Alexa 594的鬼筆環(huán)肽(phalloidin)(Invitrogen)按1◇500稀釋,于室溫與固定片孵育20 min。鍵合了Alexa 594的鬼筆環(huán)肽可與細(xì)胞肌動(dòng)蛋白結(jié)合顯示紅色熒光。PBS洗后,過一遍雙蒸水,晾干,裝片。帶有電動(dòng)Z-軸的Olympus IX81熒光顯微鏡置于隔離器中[10],每個(gè)熒光通道在Z軸取40疊。使用DAPI、FITC和德克薩斯紅濾光片。用Volocity 4.1( Improvision)軟件融合熒光通道。數(shù)據(jù)通過生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)網(wǎng)傳出。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂筏結(jié)合肌動(dòng)蛋白參與FTLVS的早期入侵

脂筏是膜脂質(zhì)雙層內(nèi)富含鞘磷脂、鞘糖脂、膽固醇、GPI-錨固蛋白和Src-kinase等的微區(qū)[11]。神經(jīng)節(jié)苷酯G M1屬于含唾液酸的鞘糖脂,鞘脂使脂筏具有不溶于非離子型去垢劑的特點(diǎn)?；魜y毒素B亞基(cholera toxin B,CTB)用于標(biāo)記脂筏中的神經(jīng)節(jié)苷酯G M1。圖1顯示FTLVS-GFP感染J774A.1細(xì)胞15 min可與神經(jīng)節(jié)苷酯G M1共定位。菲律平Ⅲ是一種結(jié)合膽固醇的制劑,插入細(xì)胞膜后顯示藍(lán)色熒光,5μg/mL可用于標(biāo)記參與脂筏形成的膽固醇成分。圖2顯示FTLVS-GFP感染J774A.1細(xì)胞15 min可與膽固醇共定位,機(jī)動(dòng)蛋白與膽固醇結(jié)合,有助于脂筏成分的運(yùn)動(dòng)。感染60 min后,與菲律平Ⅲ或神經(jīng)節(jié)苷脂G M1共定位的FTLVS-GFP難以見到,脂筏逐漸消失。細(xì)菌在胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)比較自如,圖3顯示FTLVS-GFP感染J774A.1細(xì)胞60 min周圍富集細(xì)胞肌動(dòng)蛋白,可能與細(xì)菌在胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)或胞間感染有關(guān)。

圖1 脂筏參與捕獲土拉弗朗西斯菌Fig.1 Lipid raftswere concerned with the engulfing ofFrancisella tularensisin macrophages

圖2 巨噬細(xì)胞的膽固醇參與攝取土拉弗朗西斯菌Fig.2 Cholesterolwas concerned with the uptake ofFrancisella tularensisin macrophages.

圖3 肌動(dòng)蛋白參與土拉弗朗西斯菌胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)Fig.3 Actinswere concerned with the moving ofFrancisella tularensisin macrophages

3 討 論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞成分,在非特異性免疫防御及特異性免疫應(yīng)答中均起十分關(guān)鍵的作用。巨噬細(xì)胞通過其表面受體如甘露糖受體、清道夫受體、Toll樣受體等模式識(shí)別受體(pattem recognition receptor,PRR)識(shí)別微生物表面的病原相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular pattem,PAMP),如細(xì)菌的脂多糖、脂蛋白、肽聚糖、脂磷壁酸、未甲基化的CpG DNA、分枝桿菌的脂阿拉伯甘露聚糖、酵母菌的甘露聚糖等[12];另外,巨噬細(xì)胞還能通過其表面的補(bǔ)體受體、FcγR(即IgG Fc受體,有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3種類型)調(diào)理吞噬病原體。

土拉弗朗西斯菌是一種選擇了多種優(yōu)化方式有效地侵入宿主細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)增殖的病原體。目前已報(bào)道的與土拉弗朗西斯菌攝入相關(guān)的PRR類受體主要有甘露糖受體[13]、A類清道夫受體[14],還有補(bǔ)體C3[15]和補(bǔ)體受體CR3[16]。另外,土拉弗朗西斯菌具有PAMP效應(yīng)的延長因子Tu(elongation factor Tu,EF-Tu)可與巨噬細(xì)胞表面的核仁素(nucleolin)結(jié)合而被細(xì)胞攝入[17]。前期研究也顯示巨噬細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1)[18]、質(zhì)膜微區(qū)結(jié)構(gòu)域中的窖蛋白-1(caveolin 1)[5]均參與了攝取土拉弗朗西斯菌。

質(zhì)膜微區(qū)結(jié)構(gòu)域包括瓶狀反折的小窩(含有窖蛋白)和脂筏(缺少窖蛋白)[19]。脂筏大小為55～300 nm,富含膽固醇、鞘磷脂,可結(jié)合多種蛋白質(zhì),為多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的對(duì)話提供一個(gè)平臺(tái)[20];脂筏還可以承載多種與PRR相關(guān)的協(xié)同受體調(diào)節(jié)PAMP-PRR信號(hào)[21]。

本研究免疫熒光結(jié)果顯示,巨噬細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)域中的脂筏參與了FTLVS的早期入侵。研究中采用了感染的同時(shí)用菲律平Ⅲ快速?zèng)_擊細(xì)胞,從而可以查見細(xì)菌周圍包繞富含膽固醇的結(jié)構(gòu)域(圖2C),胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白可與膽固醇結(jié)合,促進(jìn)脂筏運(yùn)載細(xì)菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞。由于菲律平Ⅲ長時(shí)間處理細(xì)胞會(huì)干擾細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)域,本研究也使用了霍亂毒素B亞基以標(biāo)記脂筏。圖1C顯示霍亂毒素B亞基所標(biāo)記的脂筏中的神經(jīng)節(jié)苷酯G M1可與細(xì)菌結(jié)合,觸發(fā)細(xì)菌的內(nèi)化。當(dāng)細(xì)菌離開細(xì)胞膜后,脂筏消失(圖3B)。隨著感染時(shí)間的推移,土拉弗朗西斯菌所在囊泡可與肌動(dòng)蛋白結(jié)合(圖3C),在胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)或引發(fā)胞間感染。

由于脂筏可以攜帶多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件,可以進(jìn)一步研究土拉弗朗西斯菌與脂筏相關(guān)的致病或免疫信號(hào)通路;由于土拉弗朗西斯菌可以離開脂筏,推測其可能產(chǎn)生了脂筏的降解物質(zhì),也值得進(jìn)一步研究。

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