張軍華,陳麗麗,李忠玉,吳移謀＊

(1.南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所,湖南衡陽 421001;2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院輸血科,湖南長沙 410013)

沙眼衣原體(Chlam ydia trachom atis,Ct)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生,具有獨(dú)特發(fā)育周期的原核型微生物,是目前國內(nèi)外最常見的性病病原體,與人類疾病相關(guān)的有2個生物型,即沙眼生物型和性病淋巴肉芽腫生物型(lymphogranuloma venereum,LGV),LGV的血清型有L1、L2和L3,其中L2進(jìn)一步被分為L2、L2a、L2b和L2′亞型[1]。LGV引起性病淋巴肉芽腫,又稱腹股溝淋巴肉芽腫(Lyphogranuloma inguinale)、第四性病,俗稱“魚口”或者“便毒”。自從2003年荷蘭男男性行為人群(men who have sex with men,MS M)中暴發(fā)流行LGV以后,相繼有許多文獻(xiàn)報道歐洲、北美和澳洲出現(xiàn)大量LGV病例,這些病例大多數(shù)由血清型LGV L2感染所致[1-4]。血清型LGV L2侵襲力較其他型強(qiáng),需更長療程的治療才能清除病原體和阻止晚期嚴(yán)重后遺癥的發(fā)生[5]。文獻(xiàn)報道,LGV的潰瘍損害與艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus,H IV)的感染和傳播密切相關(guān)[6-7],因此,LGV近年來越來越受到廣泛的重視。LGV的臨床表現(xiàn)缺乏特異性,確診依賴實驗室診斷。但目前尚沒有商品化的試劑可以診斷LGV,而病原體的分離培養(yǎng)認(rèn)為是診斷感染性疾病的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法。因此,優(yōu)化Ct血清型LGV L2的培養(yǎng)條件和比較其在不同細(xì)胞中的發(fā)育,將對Ct血清型LGV L2相關(guān)實驗研究及其感染的臨床診斷有較重要意義。研究表明Ct血清型LGV L2主要在人和非人類的上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中生存和發(fā)育,且其生長情況受細(xì)胞類型和培養(yǎng)環(huán)境影響[8-12]。本實驗選取HeLa、HEp-2、Vero 3種上皮細(xì)胞和HepG-2和SGC-7901 2種類上皮樣生長細(xì)胞培養(yǎng)血清型LGV L2,采用間接免疫熒光法和Real-Time PCR法檢測血清型LGV L2在上述5種細(xì)胞內(nèi)的生長情況,并通過設(shè)置放線菌酮組和二乙氨基葡聚糖(DEAE-dextran)處理組和不處理組,比較不同培養(yǎng)條件下血清型LGV L2在各細(xì)胞內(nèi)的生長情況,確定LGV L2血清型在體外培養(yǎng)的最佳生長發(fā)育條件,為臨床標(biāo)本中血清型LGV L2的分離培養(yǎng)和進(jìn)一步研究血清型LGV L2的相關(guān)實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞株 沙眼衣原體血清型LGV L2由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所保存;HEp-2細(xì)胞(人喉癌上皮細(xì)胞)、Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎上皮細(xì)胞)、HepG-2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)、HeLa細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)和SGC-7901(人胃癌細(xì)胞)均由南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所保存。

1.1.2 主要儀器及試劑 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Sanyo公司);生物安全柜(Haier公司);熒光顯微鏡(日本Olympus公司)和倒置顯微鏡(日本Nikon公司);兔抗衣原體屬多克隆抗體(D395)由本實驗室制備并保存,羊抗兔Cy2抗體購于Sigma公司;放線菌酮、慶大霉素和鏈霉素購自Sigma公司;Ct核酸定量檢測試劑盒購自達(dá)安基因診斷公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司,SPG轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基參考《分子克隆實驗指南》第3版附錄部分配制。

1.2 方法

1.2.1 Ct血清型LGV L2體外培養(yǎng) 按照常規(guī)方法制備HEp-2細(xì)胞單層,棄培養(yǎng)液,用HBSS液洗2次,加入含有終濃度為30μg/mL DEAE葡聚糖的DMEM培養(yǎng)基,37℃溫箱孵育10 min;用HBSS液洗2次;將凍存于-70℃的Ct血清型LGV L2標(biāo)準(zhǔn)株在37℃水浴箱1 min內(nèi)復(fù)蘇,用SPG稀釋后,接種到單層細(xì)胞上,每孔200μL,置于37℃溫箱孵育,每隔30 min輕輕搖晃1次,孵育2 h后棄去孔內(nèi)液體,加入含有10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察被感染細(xì)胞和血清型LGV L2包涵體形態(tài)的變化。

1.2.2 Ct血清型LGV L2在不同細(xì)胞內(nèi)的生長情況 按常規(guī)方法復(fù)蘇培養(yǎng)HeLa、HEp-2、Vero、HepG-2和SGC-7901細(xì)胞于24孔板中,待細(xì)胞形成80%左右的單層細(xì)胞,按前述方法接種感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MO I)為0.5的Ct血清型LGV L2,于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中分別孵育12、24、36和48 h后,進(jìn)行間接免疫熒光抗體染色,熒光顯微鏡下觀察包涵體形態(tài),在高倍鏡(40×)下隨機(jī)計數(shù)10個視野中IFU總數(shù),取平均數(shù),即為每個視野中的IFU數(shù)量;同時采用Real-Time PCR法定量檢測血清型LGV L2核酸量。

1.2.3 放線菌酮對血清型LGV L2生長發(fā)育的影響 將上述每種單層細(xì)胞分為A、B 2組,每種細(xì)胞每組12孔。分別感染MO I為0.5的Ct血清型LGV L2,A組細(xì)胞用含2μg/mL放線菌酮的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng);B組用不含放線菌酮的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng),于感染后12、24、36和48 h,進(jìn)行熒光抗體染色,觀察包涵體形態(tài),同時采用Real-Time PCR法檢測各孔血清型LGV L2核酸量,重復(fù)3次。

1.2.4 DEAE葡聚糖對Ct血清型LGV L2感染率的影響 制備上述每種單層細(xì)胞分為A、B 2組,每組3孔,A組各單層細(xì)胞用HBSS洗滌2次后,分別用含30μg/mL DEAE葡聚糖的無血清DMEM預(yù)處理10 min;B組單層細(xì)胞同步經(jīng)HBBS洗滌后用無血清DMEM培養(yǎng)基預(yù)處理10 min,然后A、B 2組各單層細(xì)胞均用HBSS洗2次,接種MO I為0.5的Ct血清型LGV L2,置于37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育36 h,高倍鏡下隨機(jī)計數(shù)10個視野中IFU總數(shù),計算每個視野中的IFU數(shù)量,同時測定各孔細(xì)胞中的血清型LGV L2核酸量。

1.2.5 熒光抗體染色 收集待染色標(biāo)本,依次用4%多聚甲醛和0.5%的Triton X-100固定和打孔,PBS洗2次后,用含2%牛血清白蛋白的封閉液于4℃孵育過夜,棄封閉液后加入一抗(兔抗衣原體多抗D395)稀釋液,于4℃孵育過夜,用PBS洗3次后加入經(jīng)稀釋后的二抗(羊抗兔Cy2),37℃避光孵育1 h,PBS洗滌3次后吹干;用鑷子夾出蓋玻片,倒扣于滴有8μL左右防熒光淬滅劑的載玻片上,熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并攝像。

1.2.6 Real-Time PCR檢測血清型LGV L2核酸量 Ct核酸定量檢測試劑盒(PCR熒光探針法)按照操作說明配好反應(yīng)體系后,將Real-T ime PCR反應(yīng)條件反應(yīng)管置于Agilent Technologies Stratagene Max3000自動熒光檢測儀進(jìn)行反應(yīng)并分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ct血清型LGV L2體外培養(yǎng)

圖1 L2感染HEp-2細(xì)胞形態(tài)變化(200×)Fig.1 Morphologic change of HEp-2 afterL2 infection(200×)

圖2 Ct血清型L2包涵體(1 000×)Fig.2 Inclusion bodies ofL2 in HEp-2 cells(1 000×)

將血清型LGV L2接種于HEp-2單層細(xì)胞,培養(yǎng)20 h后即可在光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯變化,未感染細(xì)胞呈梭形或多邊形(圖1A);而感染細(xì)胞腫脹,折光性差,感染40 h后,細(xì)胞內(nèi)可見較大包涵體,如箭頭所示(圖1B)。熒光抗體染色可見明顯包涵體(圖2)。

2.2 Ct血清型LGV L2在不同細(xì)胞內(nèi)的生長情況

血清型LGV L2分別感染HeLa、HEp-2、Vero、HepG-2和SGC-7901細(xì)胞,培養(yǎng)12 h后熒光顯微鏡下各細(xì)胞株內(nèi)可見綠色熒光小體;培養(yǎng)24 h后,發(fā)現(xiàn)各細(xì)胞株內(nèi)血清型LGV L2包涵體均增大,但大小有明顯差異;孵育36 h后,HeLa細(xì)胞內(nèi)部分包涵體破裂,其他各細(xì)胞株內(nèi)血清型LGV L2包涵體不同程度增大;孵育至48 h,SGC-7901和HeLa細(xì)胞中包涵體基本完全破裂,其他3種細(xì)胞內(nèi)均可見散在熒光小體,說明包涵體裂解釋放部分原體(圖3)。采用Real-Time PCR定量檢測孵育12、24、36和48 h后血清型LGV L2的核酸量,結(jié)果顯示HeLa細(xì)胞感染率最高,SGC-7901和HEp-2細(xì)胞次之,Vero細(xì)胞和HepG-2細(xì)胞感染率最低(圖4)。血清型LGV L2感染30 h后,分別計數(shù)5種細(xì)胞內(nèi)包涵體數(shù)量(表1),采用單因素方差分析比較5種細(xì)胞內(nèi)總體IFU均值差異,F=334 252.515,P<0.001,具有統(tǒng)計學(xué)意義,每2種細(xì)胞內(nèi)IFU均數(shù)差異采用獨(dú)立樣本t檢驗分析,均有P<0.001,具有統(tǒng)計學(xué)意義,說明細(xì)胞類型影響血清型LGV L2的生長發(fā)育。

圖3 L2在不同細(xì)胞中的發(fā)育情況(1 000×)Fig.3 The development ofL2 in difference cell lines(1 000×)

圖4 Real-T ime PCR檢測各細(xì)胞內(nèi)L2核酸量Fig.4 Quantity ofNucleic Acid ofL2 in different cells by Real-Time PCR

表1 感染30 h后5種細(xì)胞中血清型LGV L2包涵體數(shù)量Table 1 IFU ofLGV L2 in five cell lines after 30h post infection

HeLa組與HEp-2組比較t=1 075.915,P<0.01;與Vero組比較t=999.392,P<0.01;與SGC-7901組比較t=316.887,P<0.01;與HepG-2組比較t=1 266.466,P<0.01。HEp-2組與Vero組比較t=188.227,P<0.01;與SGC-7901組比較t=308.164,P<0.01;與HepG-2組比較t=301.287,P<0.01。Vero組與SGC-7901組比較t=382.571,P<0.01;與HepG-2組比較t=232.415,P<0.01。SGC-7901組與HepG-2組比較t=424.852,P<0.01。

2.3 放線菌酮對血清型LGV L2生長發(fā)育的影響

細(xì)胞感染血清型LGV L2后,分別用含放線菌酮的DMEM完全培養(yǎng)基和不含放線菌酮的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。間接免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),放線菌酮培養(yǎng)組各細(xì)胞內(nèi)血清型LGV L2包涵體開始裂解時間較對照組早,如在Vero細(xì)胞中,放線菌酮組孵育36 h后有散在熒光小點(diǎn)(圖5A),說明部分包涵體裂解,而對照組細(xì)胞內(nèi)未見散在熒光小點(diǎn)(圖5B)。Real-T ime PCR檢測結(jié)果顯示,含放線菌酮培養(yǎng)組各細(xì)胞內(nèi)血清型LGV L2核酸量較對照組大(圖6)。

圖5 L2型感染Vero細(xì)胞36 h后熒光抗體染色Fig.5 Inclusions bodies ofL2 in Vero cells at 36 h post-infection

圖6 Real-T ime PCR檢測HeLa細(xì)胞內(nèi)L2核酸量Fig.6 Quantity ofNucleic Acid ofL2 in HeLa cells by Real-Time PCR

2.4 DEAE葡聚糖對血清型LGV L2感染的影響

表2 不同處理組5種細(xì)胞內(nèi)血清型LGV L2包涵體數(shù)量(IFU/視野)Table 2 IFU ofLGV L2 in five cell lines in different treated groups

圖7 Real-T ime PCR檢測5種細(xì)胞內(nèi)L2核酸量Fig.7 Quantity ofNucleic Acid ofL2 in Five cell lines by Real-Time PCR

DEAE預(yù)處理組和對照組各細(xì)胞接種Ct血清型LGV L2,培養(yǎng)30 h后,間接熒光抗體染色,計數(shù)IFU,采用獨(dú)立樣本t檢驗比較IFU均值,發(fā)現(xiàn)2組各細(xì)胞內(nèi)IFU沒有明顯差異(表2)。Real-T ime PCR檢測培養(yǎng)12 h后各細(xì)胞內(nèi)血清型LGV L2的核酸量,發(fā)現(xiàn)DEAE對血清型LGV L2的感染沒有明顯影響(圖7)。

3 討 論

人類是血清型LGV L2的唯一宿主,在體內(nèi)主要感染上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在體外培養(yǎng)時,血清型LGV L2可在雞胚卵黃囊中增殖,也可感染人類與非人類的上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[12]。本實驗選用了上皮細(xì)胞包括HeLa細(xì)胞、HEp-2細(xì)胞和Vero細(xì)胞,另外還選擇了類上皮樣生長的HepG-2細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞。用血清型LGV L2分別感染這5種細(xì)胞,間接免疫熒光染色結(jié)果顯示,5種細(xì)胞均能感染血清型LGV L2。有文獻(xiàn)報道血清型LGV L2完成周期的時間與其他衣原體不一樣,其生長速度比其他沙眼衣原體快,感染后約18～24 h可見包涵體[12]。本實驗在接種血清型LGV L2大約24 h后,各細(xì)胞內(nèi)均可見到包涵體,與文獻(xiàn)報道基本一致[9]。

不同細(xì)胞感染血清型LGV L2后,分別于培養(yǎng)12、24、36和48 h后進(jìn)行間接免疫熒光抗體染色。結(jié)果顯示,HeLa細(xì)胞在培養(yǎng)36 h后,細(xì)胞內(nèi)部分包涵體裂解,48 h時包涵體基本完全裂解;SGC-7901細(xì)胞內(nèi)包涵體在感染后約44～48 h裂解,HEp-2細(xì)胞中在48 h左右開始裂解,Vero細(xì)胞在48 h未見裂解現(xiàn)象,但是包涵體密度減小,而在HepG細(xì)胞內(nèi)包涵體在48 h時仍較致密,說明血清型LGV L2的生長周期與細(xì)胞類型有一定的關(guān)系。通過Real-Time PCR定量檢測血清型LGV L2核酸量,發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞感染率最高,SCG-7901和HEp-2細(xì)胞次之,Vero細(xì)胞和HepG-2細(xì)胞感染率最低,采用單因素方差分析和t檢驗比較5種細(xì)胞內(nèi)IFU,發(fā)現(xiàn)各細(xì)胞間有統(tǒng)計學(xué)意義,說明血清型LGV L2在感染過程中存在一定的細(xì)胞嗜性。

目前國內(nèi)外在培養(yǎng)血清型LGV L2時,各實驗室沒有統(tǒng)一的方法。有些文獻(xiàn)報道,在接種血清型LGV L2前需用DEAE葡聚糖對宿主細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,以抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成,從而優(yōu)化衣原體的生長代謝環(huán)境,增加血清型LGV L2的感染率[12]。但有些文獻(xiàn)明確指出,血清型LGV L2具有較強(qiáng)的侵襲性,在接種過程中,不需要采用化學(xué)方法和機(jī)械輔助增強(qiáng)感染率,在培養(yǎng)過程中也不需要添加放線菌酮[9]。為此本實驗比較放線菌酮和DEAE葡聚糖對血清型LGV L2生長情況的影響。結(jié)果顯示含放線菌酮培養(yǎng)組各細(xì)胞內(nèi)包涵體開始裂解的時間比對照組早,如含放線菌酮培養(yǎng)組HeLa細(xì)胞中包涵體在36 h左右開始裂解,而對照組HeLa細(xì)胞內(nèi)包涵體在約40 h才開始裂解;Real-Time PCR結(jié)果顯示含放線菌酮培養(yǎng)組各細(xì)胞內(nèi)血清型LGV L2核酸量較對照組多,說明放線菌酮可以促進(jìn)血清型LGV L2的生長。而DEAE葡聚糖處理組與未處理組的各細(xì)胞內(nèi)血清型LGV L2核酸量和IFU沒有明顯差異,說明DEAE葡聚糖對血清型LGV L2的生長沒有明顯影響,與Scidmore等[9]報道一致,說明血清型LGV L2較其他衣原體具有更強(qiáng)的侵襲力,無需機(jī)械設(shè)備或者化學(xué)試劑輔助,即可入侵細(xì)胞。本實驗初步研究了HeLa等5種細(xì)胞對血清型LGV L2的敏感性及DEAE葡聚糖和放線菌酮對血清型LGV L2生長發(fā)育的影響,為臨床標(biāo)本中血清型LGV L2的分離培養(yǎng)和進(jìn)一步研究血清型LGV L2的相關(guān)實驗奠定了基礎(chǔ)。

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