亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        紅曲多糖液態(tài)發(fā)酵條件與抗氧化活性的研究

        2011-01-12 06:57:54汪鵬榮陳攀攀藍麗精蔣冬花林遙雪
        微生物學雜志 2011年4期
        關鍵詞:碳氮比胞外曲霉菌

        汪鵬榮,陳攀攀,藍麗精,蔣冬花,林遙雪

        (浙江師范大學化學與生命科學學院,浙江金華 321004)

        真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的由10個以上的單糖以糖苷鍵連接而成的不溶于高濃度乙醇、正丁醇及丙酮等有機溶劑的高分子多聚物,與動、植物多糖不同,真菌多糖分子單體之間主要以β-1,3與β-1,6糖苷鍵結合,形成鏈狀分子,具有螺旋狀的立體構型[1]。自1970年日本千原羽田從香菇中分離出一種抗腫瘤的多糖后,科學界掀起了食用真菌多糖研究的熱潮。真菌多糖在國際上被稱為“生物反應調節(jié)物”(biological response modifier,簡稱BRM),具有很大的應用開發(fā)價值。大量的藥理實驗表明,真菌多糖具有還原能力,可以消除體內的自由基,具有抗氧化性,因而具有刺激免疫、抗腫瘤、降低糖脂、延緩衰老等活性,己經被廣泛應用于醫(yī)療保健領域[2]。目前,已在國內臨床應用的真菌多糖主要有香菇多糖、云芝多糖、云芝糖肽、靈芝肽多糖、猴頭菌多糖、銀耳多糖等[3]。紅曲霉是一類十分重要的藥用真菌,紅曲霉發(fā)酵制成的中藥紅曲具有活血化瘀、健脾消食等功效及降脂、降壓、降糖和抗腫瘤等作用[4],在食品、色素、中藥等領域也有廣泛的應用,隨之紅曲霉的次級代謝產物也成為研究焦點[5]。多糖類物質是紅曲霉所含有的重要化學成分之一,相關研究表明紅曲多糖具有抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力等多種功能[6-8]。紅曲多糖可像靈芝多糖一樣通過液態(tài)發(fā)酵而實現(xiàn)工業(yè)化生產,但目前國內對紅曲多糖的發(fā)酵生產工藝研究不多,相關報道的胞外多糖產量普遍較低,尚處于探索階段。通過從不同環(huán)境中采集來的紅曲米中分離篩選出1株高產胞外多糖紅曲霉菌株Mr-70,對其培養(yǎng)基組分及液態(tài)發(fā)酵條件進行優(yōu)化,并進一步對胞外粗多糖清除DPPH自由基的能力進行了研究,以期為紅曲多糖的工業(yè)化生產及應用提供理論和實踐指導。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 菌種來源 紅曲霉菌株Mr-70分離自浙江金華地區(qū)采集來的紅曲米。

        1.1.2 培養(yǎng)基 ①斜面培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,水1 000 mL,pH自然(固體培養(yǎng)基加瓊脂粉18 g);②種子培養(yǎng)基[9]:葡萄糖50 g,蛋白胨5 g,酵母膏1 g,KH2PO41 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,水1 000 mL,pH 6.0;③發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50,蛋白胨20,KH2PO4·3H2O 8,MgSO40.5,pH 6.0。

        1.1.3 試劑 二苯代苦味?;杂苫?DPPH·)、甲醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、番薯粉、乳糖、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鈉、尿素、無水乙醇,均為國產分析純;試驗用水為去離子水。

        1.1.4 實驗設備 LRH-280生化培養(yǎng)箱,廣東醫(yī)療器械廠;C24KC生物恒溫搖床,CERTIFIED;M IKRO-22R高速冷凍離心機,德國Hettichi公司;UV-7504紫外可見分光光度計,上海欣茂儀器公司;DHG-9101.28A電熱恒溫鼓風干燥箱,山東鄄城科源儀器設備廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,山東鄄城科源儀器設備廠;JA3003A天平,上海精天電子儀器有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 菌種活化 將保存的紅曲霉菌株Mr-70用接種針接入斜面培養(yǎng)基,30℃恒溫培養(yǎng)5 d。

        1.2.2 種子液制備 用打孔器(直徑0.8 cm)取30℃培養(yǎng)5 d的平板菌種5塊分別接種到種子培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶裝入50 mL液體培養(yǎng)基),30℃,于200 r/min的旋轉式搖床培養(yǎng)48 h。

        1.2.3 液體發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)48 h的種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為8%,250 mL三角瓶裝100 mL培養(yǎng)液,180 r/min、30℃培養(yǎng)96 h,最后取發(fā)酵液分析檢測粗多糖的產量。

        1.2.4 發(fā)酵液中多糖含量的測定[10-11]發(fā)酵濾液定容至100 mL,取適量發(fā)酵液,5 000 r/min離心30 min,將所獲上清液抽濾,除去其中的不溶物,取上清液15 mL加入60 mL無水乙醇中,在5℃下靜置8 h過濾,沉淀在80℃烘干12 h至恒重,稱量即為胞外粗多糖含量。

        1.2.5 胞外粗多糖清除DPPH的測定方法[12-13]DPPH·是一種在有機溶劑中非常穩(wěn)定的自由基,呈紫色,不溶于水,可溶于甲醇溶液,在517 nm處有一個特征吸收峰,當其遇到自由基清除劑時,與DPPH的孤電子配對,使其顏色變淺,在最大吸收波長處的吸光度變小。配制不同濃度的粗多糖溶液,離心取2 mL上清于試管中,再加入2 mL DPPH的甲醇溶液(DPPH濃度為1×10-4mol/L),混合均勻,0.5 h后用分光光度計在517.4nm處測定其吸光度Ai;同時測2 mL DPPH溶液+2 mL甲醇混合后的吸光度A0和2 mL提取液+2 mL甲醇混合后的吸光度Aj,實驗中每個濃度平行做3次,取其平均值。按下式計算對自由基的清除率:

        2 結果與分析

        2.1 碳源對胞外多糖產量的影響

        以液體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎,分別采用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、番薯粉、乳糖為碳源進行試驗(碳源質量濃度設定為50 g/L),將紅曲霉菌Mr-70接入上述各發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃條件下,以200 r/min的速度搖瓶培養(yǎng)96 h,對發(fā)酵液中的多糖含量和菌體生物量進行初測,實驗重復3次。實驗結果顯示(表1),紅曲霉菌Mr-70利用以上6種物質產胞外多糖的能力依次是葡萄糖>蔗糖>麥芽糖>乳糖>番薯粉>淀粉,其中以葡萄糖為唯一碳源時的胞外多糖產量最高達5.63 g/L,而從菌絲體產量來看葡萄糖和麥芽糖是最適合紅曲霉生長的碳源,因此確定葡萄糖為最適碳源。

        表1 不同碳源對M r-70發(fā)酵產胞外多糖能力的影響Table 1 The effects of carbon sources on the MEP yield of Mr-70

        2.2 氮源對胞外多糖產量的影響

        以液體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎,分別采用蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鈉、尿素為氮源進行試驗(氮源質量濃度設定為20 g/L),將紅曲霉菌Mr-70接入上述各發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)96 h,對發(fā)酵液中的多糖含量和菌體生物量進行初測。由表2顯示有機氮源比無機氮源更有利于紅曲霉菌Mr-70的生長,其中蛋白胨和酵母膏對菌絲體生長最有利,但是蛋白胨是最佳產胞外多糖所需的氮源,因此,選擇蛋白胨作為紅曲霉菌Mr-70的最適氮源。

        表2 不同氮源對M r-70發(fā)酵產胞外多糖能力的影響Table 2 The effects of nitrogen sources on theMEP yield ofMr-70

        2.3 碳氮比對胞外多糖產量的影響

        以液體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎,在上述碳氮源實驗的基礎上,分別選取碳氮比(質量比)1◇1、2◇1、3◇1、4◇1、5◇1、6◇1進行碳氮比篩選實驗。將紅曲霉菌Mr-70接入上述各類碳氮比不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)96 h,對發(fā)酵液中的多糖含量進行初測,實驗重復3次。由圖1可知,紅曲霉菌Mr-70菌絲體的產量隨碳氮比的增加而增加;胞外多糖產量先隨著碳氮比的增加而增加,當碳氮比為3◇1時達到最大值8.40 g/L,然后隨著碳氮比的增加多糖產量反而下降。過高的碳氮比只適合菌體的生長卻不利于菌體分泌胞外多糖,過低則會影響菌體的生長和胞外多糖的分泌,因此紅曲霉菌Mr-70最適產胞外多糖的碳氮比初步確定為3◇1。

        圖1 不同碳氮比對紅曲霉菌M r-70菌絲體生長和產胞外多糖的影響Fig.1 The effects of ratio ofm(C):m(N)on theMEP yield ofMr-70

        2.4 無機鹽濃度對胞外多糖產量的影響

        以上述最適碳氮比為基礎配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基,分別選取不同濃度的無機鹽添加量:KH2PO4·3H2O(2、4、6、8、10、12 g/L)、MgSO4(0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 g/L)進行最適無機鹽濃度篩選實驗。將紅曲霉菌Mr-70接入上述各類無機鹽濃度不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)96 h,對發(fā)酵液中的多糖含量進行初測,實驗重復3次。無機鹽是微生物生長和產代謝產物必須的營養(yǎng)物質。培養(yǎng)基中無機離子種類與濃度對微生物胞外多糖的合成有重要影響,并同時影響胞外多糖的化學組成和物性[14]。其中P、S、K、Mg 4種礦質元素必須通過外界添加才可達到菌體生長所需濃度,對于這幾種元素來源,首選KH2PO4·3H2O和MgSO4,可以同時提供這4種元素[15],因此有必要通過實驗確定KH2PO4·3H2O和Mg-SO4的最適添加量,實驗結果見圖2。由圖2可知,無機鹽濃度對紅曲霉菌絲體生長的影響不太明顯,但對胞外多糖產量的影響卻很明顯,當Mg-SO4和KH2PO4·3H2O濃度分別為1.1 g/L(圖2a)、10 g/L(圖2b)時多糖產量達到最大值8.56 g/L。

        圖2 無機鹽添加量對胞外多糖產量的影響Fig.2 The effects of concentrations of KH2PO4·3H2O andMgSO4on theMEP yield ofMr-70

        2.5 培養(yǎng)基起始pH對胞外多糖產量的影響

        圖3 培養(yǎng)基起始pH值對胞外多糖產量的影響Fig.3 The effects of initial pH on theMEP yield ofMr-70

        將菌種接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,以3.5為初始pH,0.5一個梯度,逐漸增加至7.0,通過對不同初始pH值的測試,獲取最佳初始pH。將紅曲霉菌Mr-70接入上述各類起始pH不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)96 h,對發(fā)酵液中的多糖含量進行初測,實驗重復3次。多糖的合成在多種酶的共同催化作用下完成,pH可影響培養(yǎng)基中有效成分的溶解性及運輸、相關酶活性、副產物的形成及發(fā)酵過程中的氧化還原反應,從而影響微生物的生長與代謝[16]。由圖3可知,酸性環(huán)境更有利于菌絲體生長,卻不利于胞外多糖的產生,當pH為6.5時紅曲霉Mr-70胞外粗多糖產量達到最大值8.7 g/L。

        2.6 搖床轉速對胞外多糖產量的影響

        將紅曲霉菌Mr-70接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,以最佳pH值為條件。選取0、50、100、150、200、250 r/min 6個轉速梯度,測試Mr-70產胞外多糖的最佳搖床轉速。大多數(shù)產胞外多糖的微生物需氧才能合成胞外多糖,故發(fā)酵過程中通氣極為重要,過高或者過低都不利于菌絲體生長,進而影響胞外多糖產量。紅曲霉是一種好氧真菌,本實驗通過改變轉速來改變搖瓶通氣量,由圖4可知,紅曲霉菌絲體的生長隨著搖床轉速的增加而增加,當搖床轉速為250 r/min時菌絲體量達到最大值21.04 g/L;搖床轉速在50~200 r/min時,多糖產量隨著搖床轉速的增加而增加,但是過高的氧氣含量卻不利于胞外多糖的產生,當搖床轉速為200 r/min胞外粗多糖產量達到最大值9.33 g/L。

        圖4 搖床轉速對胞外多糖產量的影響Fig.4 The effects of rotation speeds on theMEP yield ofMr-70

        2.7 搖瓶溫度對胞外多糖產量的影響

        將紅曲霉菌Mr-70接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中,以最優(yōu)pH和最優(yōu)搖床轉速為條件,測試從20~40℃下不同的胞外多糖產量,以確定最佳搖瓶溫度。微生物的生命活動都是由一系列生物化學反應組成的,這些反應都要在各種酶的催化下進行,而溫度是保證酶活性的重要因素,因此,在發(fā)酵過程中保證穩(wěn)定合適的溫度具有重要意義[17]。溫度可以影響微生物體內的各種化學反應的進行,進而影響微生物的生長和各種代謝產物的積累,因此每種微生物都有其最適的生長溫度和最適的產胞外多糖溫度。由圖5可知,當搖瓶溫度在20~36℃之間時,菌絲體的產量隨著溫度的增加而增加,當溫度高于36℃時菌絲體產量開始緩慢下降;而胞外多糖產量在溫度為32℃時達到最大值10.15 g/L,因此紅曲霉菌Mr-70的最適生長溫度(36℃)與其最適產胞外多糖溫度(32℃)不完全一致。

        圖5 搖瓶溫度(℃)對胞外多糖產量的影響Fig.5 The effects of temperature on the MEP yield of Mr-70

        2.8 粗多糖的抗氧化活性測定結果

        圖6 不同濃度的胞外粗多糖對DPPH·的清除作用Fig.6 The scavenging effect ofMEP on DPPH·

        DPPH·分析法被廣泛用于清除自由基物質活性的研究,可評價有機清除劑的活性[18]。不同濃度的胞外粗多糖的DPPH·清除能力見圖6。由圖6可知,當粗多糖濃度在0.5~2 mg/mL時,對DPPH·的清除能力呈現(xiàn)對數(shù)增長趨勢;當粗多糖濃度超過2 mg/mL時,對DPPH·的清除能力增加緩慢。Tseng等[19]從靈芝中提取的多糖,在濃度為5 mg/mL時,對DPPH·清除率為36.4%~58.4%;葉明等[20]從黑芝胞外提取的多糖,在濃度為40 mg/mL時對DPPH·清除率為23.4%,而5 mg/mL的紅曲霉胞外粗多糖的DPPH·清除率就達82.24%,因此,紅曲霉胞外粗多糖表現(xiàn)出較強的DPPH·清除能力。

        3 結 論

        通過對紅曲霉液體發(fā)酵生產條件進行研究,初步得出紅曲霉菌Mr-70產胞外多糖的最適培養(yǎng)條件:葡萄糖60 g/L,蛋白胨20 g/L,K2HPO410 g/L,MgSO4·7H2O 1.1 g/L,發(fā)酵液起始pH 6.5,32℃、200 r/min搖床培養(yǎng)96 h,紅曲霉菌株Mr-70的胞外粗多糖產量可達10.15 g/L。

        二苯代苦味?;杂苫?DPPH·)是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,若樣品能清除它,則提示樣品具有降低羥自由基、烷自由基或過氧自由基的有效濃度和打斷脂質過氧化鏈反應的作用[21]。紅曲霉胞外粗多糖對DPPH·具有較強的清除能力,表明紅曲霉胞外粗多糖具有良好的體外抗氧化活性,而且紅曲霉胞外粗多糖是一種天然提取物,具有成本低廉、安全無毒等特點,因此,紅曲霉胞外粗多糖作為天然抗氧化劑具有很好的開發(fā)應用前景。

        [1] WangQ,Huang X Q,Nakamura A,et al.Molecular characterisation of soybean polysaccharides:an approach by size exclusion chromatography,dynamic and static light scattering methods[J].Carbohydrate Research,2005,340(1):2637-2644.

        [2] Yang XB,Gao X D,Han F,et al.Sulfation of a polysaccharide produced by a marine filamentous fungus Phoma herbarum YS4108 alters its antioxidant propertiesin vitro[J].Biochim BiophysActa,2005,1725(1):120-127.

        [3] 王舒寧.真菌多糖免疫調節(jié)作用的研究進展[J].福建畜牧獸醫(yī),2009,31(3):14-16.

        [4] 邢旺興,程榮珍,宓鶴,等.幾種常見紅曲霉的生理學特性研究[J].藥學實踐,2001,19(4):231-232.

        [5] 李秀巖,魏健,孫振雷.紅曲多糖的提取與發(fā)酵工藝的優(yōu)化[J].安徽農業(yè)科學,2006,34(21):5653-5654.

        [6] 丁紅梅.紅曲多糖抑瘤作用初步研究[J].菌物研究,2007,5(3):171-173.

        [7] 曾露燕,趙樹欣,李燚.紅曲霉抑菌成分糖肽類物質的分離純化及穩(wěn)定性[J].天津科技大學學報,2009,2(4):18-21.

        [8] 張建峰,昌友權,陳光,等.紅曲多糖的免疫活性研究[J].食品科學,2008,29(2):391-393.

        [9] 蔣冬花,后家衡,李杰,等.紅腐乳中高產γ-氨基丁酸紅曲霉菌株的篩選[J].浙江師范大學學報(自然科學版),2007,30(4):447-452.

        [10] 趙振鋒,方惠英,諸葛健.紅曲霉發(fā)酵產胞外多糖工藝的優(yōu)化[J].無錫輕工大學學報,2002,2(3):289-295.

        [11] 冮潔,宋紅梅.鉚釘菇菌絲體液體培養(yǎng)產胞外多糖條件的研究[J].食用菌,2009,31(3):14-16.

        [12] 許平.黃瓜多糖抗氧化活性研究[J].重慶工商大學學報(自然科學版),2009,2(1):54-56.

        [13] 趙愛云,胡博路,杭瑚,等.部分植物抗氧化活性的初步研究[J].天然產物研究與開發(fā),2000,12(3):42-44.

        [14] MartinsL O.Roles ofMn2+,Mg2+and Ca2+on alginate biosynthesis byPseudomonasae ruginosa[J].Enzyme Microbial Technol,1990,12(10):794-799.

        [15] 周德慶.微生物學教程(第2版)[M].北京:高等教育出版社,2002:92.

        [16] Forage R,Harisson D,Pit D.Effect of environment on microbial activity[J].In:Comprehensive Biotechnology,Moo-YoungM(eds)Oxford,New York:Pergamon Press,1985:253-279.

        [17] 吳彩琴,陳野,郝迎.冬蟲夏草液體發(fā)酵生產多糖和菌絲體的研究[J].食品科學,2009,30(5):171-174.

        [18] 胡喜蘭,韓照祥,陶瑩,等.DPPH法測定17種植物的抗氧化活性[J].食品科技,2006,(10):264-268.

        [19] Tseng YH,Yang JH,Mau JL.Antioxidant properties of polysaccharides from Ganoder ma tsugae[J].Food Chemistry,2008,107(2):732-738.

        [20] 葉明,陳九山,楊柳,等.黑芝胞外多糖提取工藝條件優(yōu)化及體外抗氧化活性研究[J].食品科學,2009,30(8):47-50.

        [21] 康海權,陳亞琪,陳秋平,等.油茶果殼多糖的抗氧化作用及單糖組成[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2010,36(4):36-38.

        猜你喜歡
        碳氮比胞外曲霉菌
        硝化顆粒污泥胞外聚合物及信號分子功能分析
        生物膜胞外聚合物研究進展
        雞曲霉菌病的發(fā)病特點、臨床癥狀、鑒別與防治
        內蒙古草原露天礦區(qū)復墾地重構土壤碳氮比差異及影響因素研究
        肺曲霉菌合并肺放線菌感染一例
        佩特曲霉菌次生代謝產物的研究
        中成藥(2017年7期)2017-11-22 07:33:13
        水華期間藻類分層胞外聚合物與重金屬的相互作用機制研究
        云煙85不同葉位和不同部位烤后煙葉碳氮含量和碳氮比的差異性研究
        白藜蘆醇對紅色毛癬菌和煙曲霉菌抑菌作用比較
        動物雙歧桿菌RH胞外多糖基因簇的克隆及分析
        食品科學(2013年15期)2013-03-11 18:25:36
        97丨九色丨国产人妻熟女| 国产颜射视频在线播放| 国产激情视频高清在线免费观看| 日本最新一区二区三区视频观看| 国产在线观看无码免费视频| 狠狠色狠狠色综合| 看全色黄大色大片免费久久久| 国产高潮流白浆视频在线观看 | 日韩人妻一区二区中文字幕| 无套熟女av呻吟在线观看| 午夜福利92国语| 日日爽日日操| 手机av在线播放网站| 天堂国产一区二区三区| 蜜桃臀无码内射一区二区三区| 中文字幕高清无码不卡在线| av一区二区在线网站| 国产精品亚洲lv粉色| 亚洲AV色无码乱码在线观看| 亚洲妇女av一区二区| 激情亚洲一区国产精品| 亚洲综合国产一区二区三区| 国产激情视频在线观看首页| 一二三四在线观看韩国视频| 少妇高潮av久久久久久| 久久av无码精品人妻出轨| 国产免费午夜福利蜜芽无码| 日本黑人乱偷人妻在线播放| 久久精品黄aa片一区二区三区| 成年女人A级毛片免| 日本中文字幕官网亚洲| 日本一道综合久久aⅴ免费| 欧美情侣性视频| 在线免费观看亚洲天堂av| 音影先锋中文字幕在线| 亚洲日韩欧洲无码av夜夜摸 | 国产精品国产三级厂七| av网站免费线看精品| 国产成人亚洲精品无码h在线| 亚洲欧美日韩在线精品2021 | 精品免费国产一区二区三区四区|