李 燕,余正波,李 政,高 冰,陶興無

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023)

木瓜〔Chaenomeles sinensis(Thouin.)Koehne〕,屬薔薇科木瓜屬植物,是我國特有果木之一,木瓜的營養(yǎng)價(jià)值很高,含有多種礦物元素和維生素[1]。木瓜還具有藥用和觀賞價(jià)值[2],且有“百益之果”之稱。但鮮木瓜含有大量有機(jī)酸[3],帶有酸、澀味,纖維較多,口感較差,通常不鮮食。木瓜作果醋可以降低醋酸的刺激感,結(jié)合木瓜本身含有的有機(jī)酸和護(hù)肝抗病毒的齊墩果酸等有效藥理成分,木瓜果醋可以發(fā)揮其特殊的保健作用[4]。木瓜本身的含糖量很低,我們嘗試用含糖量較高的且營養(yǎng)豐富的萌芽米,進(jìn)行木瓜萌芽米復(fù)合果醋的釀制。萌芽米富含γ-氨基丁酸 (γ-Aminobutyric Acid,GABA),營養(yǎng)醫(yī)學(xué)研究證明,GABA為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具有降壓、抗驚厥、改善腦機(jī)能、促進(jìn)長期記憶和生長激素分泌等功能[5]。

目前有關(guān)木瓜果醋的研究報(bào)道[6-8],均以醋酸菌和酵母菌為菌種,并使用糖化酶等工業(yè)酶,關(guān)于多菌種混合發(fā)酵尤其是與乳酸菌聯(lián)合發(fā)酵釀制木瓜果醋的研究尚未見報(bào)道。我們在木瓜萌芽米復(fù)合果醋的釀造過程中,加入乳酸菌增加果醋中乳酸的含量,可促進(jìn)加速發(fā)酵過程的進(jìn)行;接入紅曲霉和黑曲霉,利用紅曲霉和黑曲霉生長過程中產(chǎn)生的淀粉酶、糖化酶等活性酶進(jìn)行糖化處理,增加還原糖含量的同時(shí),也帶進(jìn)抑制膽固醇合成的莫納克林 K(Monacolin K)等功能性營養(yǎng)物質(zhì)[9];從而研制出風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)保健的木瓜醋,對開發(fā)木瓜保健調(diào)味品具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 原料、菌種、試劑、培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)儀器

原料：市售木瓜,無腐爛,成熟適中;萌芽米;大片麩皮 (湖北荊門)。

菌種：紅曲霉 M1(MKA2.8%),M2(MKA2.2%);黑曲霉 (滬釀 AS3.324);乳酸菌 (Prs.5、YRS7);醋酸菌 (CSJ);酵母菌 (安琪釀酒高活性增香干酵母)、酵母 1807;除黑曲霉與酵母菌外,菌種均為武漢工業(yè)學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室分離保藏的食用菌種。

1.1.1 試劑與培養(yǎng)基

試劑：碳酸鈉,食用級;菲林試劑,自配;1%次甲基藍(lán)溶液,自配;0.2%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液,自配;0.1mol/LNaoH標(biāo)準(zhǔn)溶液,自配;0.1%酚酞試劑,自配;冰醋酸,分析純;氯化鈣,分析純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

培養(yǎng)基：醋酸菌篩選培養(yǎng)基：葡萄糖 1%,酵母膏 1%,2%CaCO3,2%瓊脂,滅菌后 70℃時(shí)按培養(yǎng)基的 4%加入無水乙醇;

醋酸菌保藏培養(yǎng)基：葡萄糖 1%,酵母膏 1%,2%CaCO3,2%瓊脂,滅菌后 70℃時(shí)每 100mL培養(yǎng)基滴加 3—4滴無水乙醇;

醋酸菌活化培養(yǎng)基：葡萄糖 1%,酵母膏 1%,滅菌后 70℃時(shí)每 100mL培養(yǎng)基加入 4%的無水乙醇 5mL。

乳酸菌培養(yǎng)基：乳糖 2%,碳酸鈣 1%,氯化鈉0.5%,蛋白胨 5%,牛肉膏 0.3%,酵母膏 3%,瓊脂2%—2.5%,調(diào) pH至 6.8;

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

超凈工作臺、電熱恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、電熱手提式蒸氣滅菌鍋、生化恒溫培養(yǎng)箱、HH—S2S恒溫水浴鍋、JJ—1型定時(shí)電動(dòng)攪拌器、pHS—3C精密pH計(jì)、LD5-2A定時(shí)離心機(jī)等。

1.2 方法

1.2.1 麩曲的制備及菌種的活化

麩曲的制備：黑曲霉麩曲：95 g麩皮,5 g棉粕,80%水 2mL冰醋酸,混合裝瓶滅菌,無菌操作接入黑曲滬釀 AS3.324,培養(yǎng) 7d;紅曲霉麩曲：100g萌芽米,80%水,2ml冰醋酸,混合裝瓶滅菌,無菌操作接入紅曲 M1、M2,培養(yǎng) 7d;

乳酸菌的培養(yǎng)：無菌操作將乳酸菌接入MRS液體培養(yǎng)基,35℃恒溫培養(yǎng) 2d。

酵母菌的活化：用 3%的稀糖水加 1%的安琪釀酒活性干酵母,30℃左右開放條件下不斷攪拌 30—60min,直到糖水中出現(xiàn)大量微小氣飽為止。

醋酸菌的培養(yǎng)與活化[10]：本實(shí)驗(yàn)采用的是從醋醅中分離的優(yōu)良菌種。保藏菌種先經(jīng)斜面活化(32—34℃,16—24 h)后,轉(zhuǎn)入醋酸菌活化培養(yǎng)基50mL/250mL三角燒瓶中,4層紗布封口,恒溫?fù)u床(200 r/min,32℃)培養(yǎng) 24 h(總酸度 ≥1%)。

1.2.2 工藝流程

工藝流程見圖1。

圖1 果醋加工工藝流程圖

1.2.3 工藝要點(diǎn)

木瓜汁：選擇成熟未腐爛變質(zhì)的木瓜,用清水沖洗數(shù)次,切開去籽去瓤,以免產(chǎn)生厚重的苦味,切成2 cm見方的小方塊,用榨汁機(jī)榨汁,測酸度和還原糖含量。

萌芽米糖化醪的制備：取萌芽米,粉碎 (90%以上不低于 40目),按 1∶6的比例兌水與木瓜混合,加熱煮成糊狀 (14-16°Be),加入氯化鈣 (相當(dāng)于總質(zhì)量的 1‰),用調(diào)節(jié) pH至 7.5—8.0,92℃—100℃液化 2 h,液化后冰醋酸調(diào)節(jié) pH至 4.5—5.0,加入紅曲麩曲、黑曲麩曲,水浴 60—65℃菌酶水解 (糖化)6—8 h。待糖的還原值升到最高終止,進(jìn)入下一工序。

酒精發(fā)酵：以上糖化醪液,降溫至 38℃以下加入 1‰的高溫活性干酵母,生香干酵母和乳酸菌 (總醪液量的 2%)。干酵母在使用前應(yīng)擴(kuò)大活化 2h接入,前期酵母增殖期需要 35℃左右開放培養(yǎng) 6—8 h,待醪液表面產(chǎn)生大量氣泡并且持久不消失時(shí),將其密封轉(zhuǎn)為主發(fā)酵期 (35—38℃)。待酒精度不再上升為止,即為酒化醪,巴氏消毒后,進(jìn)入下步工序;總發(fā)酵時(shí)間為 72 h左右。

醋酸發(fā)酵：按酒化醪與醋酸菌的體積比 10∶1接入經(jīng)活化的醋酸菌于成熟的酒化醪中,置恒溫?fù)u床上進(jìn)行醋酸發(fā)酵,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為 150 r/min,32℃培養(yǎng)3d后,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為 300 r/min,以促進(jìn)醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸。后期為了防止醋酸過度氧化生成二氧化碳和水,置恒溫養(yǎng)箱培養(yǎng)。每 8 h測定一次酸度的變化,當(dāng)酸味純正、連續(xù)幾次測定酸含量不再增加或增加緩慢時(shí)即可結(jié)束醋酸發(fā)酵。經(jīng)過濾、澄清,滅菌后即得成品醋。

1.3 分析項(xiàng)目及方法[11]

食醋中總酸的測定：酸堿中和法;

酒精度測定：蒸餾法測定;

總糖和還原糖 (以葡萄糖計(jì))的測定：DNS試劑法。

微生物的檢測：按 (GB2746-85)食品衛(wèi)生微生物檢測方法測定;

感官評定：從色澤,形態(tài),口感香氣四個(gè)方面評價(jià),采用 100分制。

1.4 發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化

由于不同的原料配比及菌種,在相同的條件下制得的復(fù)合果醋在色澤,風(fēng)味,和口感上會(huì)有明顯的差異[12],因此本實(shí)驗(yàn)控制溫度、酸度等外界條件,研究不同配方及不同的菌種接入釀造果醋,根據(jù)檢測結(jié)果篩選出最佳方案。

將萌芽米,木瓜,紅曲霉麩曲、黑曲霉麩曲,按不同比例配比進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并在對照組中加入乳酸菌,對比其發(fā)酵結(jié)果。具體方案見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

續(xù)表

按上述實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),其中方案 2,3,5,8效果較好,選擇這四組方案進(jìn)行工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn),從而確定最佳工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 液態(tài)發(fā)酵中還原糖的變化

木瓜萌芽米復(fù)合果醋的釀造過程中,主要利用紅曲霉、黑曲霉生長過程中產(chǎn)生的淀粉酶、糖化酶、纖維素酶等活性酶進(jìn)行糖化,增加還原糖含量的同時(shí),也帶進(jìn)莫納克林 K等功能性營養(yǎng)物質(zhì)。糖化過程中還原糖的變化見圖2。

圖2 糖化與酒精發(fā)酵階段還原糖的變化

根據(jù)趨勢線可以觀察到原料在經(jīng)過 2h的液化階段后還原值均維持在 2.0 g/100mL左右,進(jìn)入糖化階段,還原值均迅速上升。在反應(yīng)進(jìn)行到 10 h左右時(shí)達(dá)到最高峰。當(dāng)原料處在酒精發(fā)酵的前階段中,前 8 h由于酵母處在增殖期,因此還原糖值下降緩慢,當(dāng)進(jìn)行到 18 h左右時(shí),酒精發(fā)酵進(jìn)入主發(fā)酵期,還原糖被大量消耗,其還原值也大幅度的下降,直到維持在 0.1 g/100mL左右。其中在糖化階段,方案 5還原糖值在糖化階段上升的最高為 6.21 g/100mL,其次是方案 2為 5.85g/100mL,方案 8還原糖值最低 5.54g/100mL。在酒精發(fā)酵階段方案 8下降的最快。

2.2 液態(tài)發(fā)酵中酒精度的變化

酒精發(fā)酵在整個(gè)液態(tài)發(fā)酵過程中很重要,酒精發(fā)酵的能力直接影響到下一步醋酸發(fā)酵的效果。根據(jù)趨勢圖 (圖2),可以觀察到糖化階段后期就有酒精的產(chǎn)生,這不是酵母產(chǎn)生的,而是紅曲進(jìn)行酒精發(fā)酵的結(jié)果,以前的試驗(yàn)中也證實(shí)紅曲有酒精發(fā)酵能力。在酒精發(fā)酵階段初期,酒精度緩慢上升,8 h后進(jìn)入主發(fā)酵階段,酒精度迅速上升,70h左右時(shí)達(dá)到最高。

酒精發(fā)酵階段中方案 5的酒精度最高為 6.9%(V/V),但是發(fā)酵所需要的時(shí)間最長。其次是方案 8為 6.1%(V/V),但是其發(fā)酵的時(shí)間最短。方案 2和方案 3發(fā)酵中的酒精度要比方案 5和方案 8低?？梢?加入乳酸菌可促進(jìn)加速發(fā)酵過程的進(jìn)行。

圖3 酒精度在發(fā)酵過程中的變化

2.3 液態(tài)發(fā)酵中酸度的變化

酸度在酒清發(fā)酵階段維持在 0.7 g/100mL左右,是正常酒精發(fā)酵特征。在醋酸發(fā)酵階段,前期數(shù)據(jù)呈波浪形上升趨勢,整個(gè)過程持續(xù)了 6 d,達(dá)到最高酸度。其中,1—4 d酸度上升較快,而 4—6 d酸度上升平穩(wěn)。在趨勢圖中可以發(fā)現(xiàn)方案 8的酸度最高為 3.62g/100mL,在發(fā)酵到 150 h后上升緩慢,最終維持在 3.61左右。其次為方案 5,最高酸度為3.57g/100mL。在發(fā)酵到 160 h后上升緩慢 ,最終維持在3.55g/100ml左右。方案2和方案3的最高酸度要明顯低于方案 5和方案 8。

圖4 發(fā)酵過程中酸度的變化

2.4 萌芽米木瓜復(fù)合果醋的質(zhì)量檢測

2.4.1 感官指標(biāo)

色澤：淡黃色,透明,光澤度好;香氣：具有木瓜特有的香味;口味：酸甜可口,無其它異味;體態(tài)：澄清透明,無懸浮物。感官評分見表2和表3。

表2 評分細(xì)則表和表3

表3 感官評測表

感官指標(biāo)排名：5＞8＞2＞3,從排名中可以發(fā)現(xiàn)5與 8組 (加乳酸菌)要比 2與 3組對照組在相同外界條件下的產(chǎn)醋質(zhì)量和品質(zhì)高。

2.4.2 理化指標(biāo)

總酸 (以酸度計(jì))：≥3.62 g/100mL;可溶固形物 ：≥5 g/100mL;砷 (以 As計(jì) )：≤0.5mg/kg;鉛 (以Pb計(jì))：≤1.0mg/kg,桔霉素未檢出。

2.4.3 微生物指標(biāo)

細(xì)菌個(gè)數(shù)：≤100個(gè) /mL;大腸桿菌群：≤3/100 mL,致病菌未檢出。

3 結(jié)論

最佳木瓜萌芽米復(fù)合果醋釀造工藝：(1)木瓜萌芽米質(zhì)量比 3∶5,液化溫度 92℃,糖化過程溫度60℃,紅曲接種量為 2%,黑曲接種量為 1%,(2)酒精發(fā)酵溫度 32℃,干酵母用量為 1‰,乳酸菌接入量2%,(3)醋酸發(fā)酵的溫度 35℃,醋酸菌接種量 5%。糖化階段還原糖值可以達(dá)到 6.21 g/100mL,酒精發(fā)酵階段酒精度可以達(dá)到 6.9%(V/V),醋酸發(fā)酵階段酸度可以達(dá)到 3.62 g/100mL,生產(chǎn)的果醋具有濃郁的果醋味,酸甜適度,色澤透明。

[1] 王紹美,何照范,郁建平.木瓜營養(yǎng)成分分析[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào)、2000(2)：190-192.

[2] 徐興東,崔愛君,孫佩菊,等.木瓜優(yōu)良品種簡介 [J].北方果樹、1996(1)：18-19.

[3] 高誠偉,康 勇,雷澤橫,等.皺皮木瓜中有機(jī)酸的研究 [J].云南大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版),1999,21(4)：319-321.

[4] 韓立敏.木瓜的營養(yǎng)保健功能及其開發(fā)利用[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)、2009(9)：138-148.

[5] 張 暉,姚惠源,姜元榮.富含γ-氨基丁酸保健食品的應(yīng)用與開發(fā)[J].食品與工業(yè)發(fā)酵、2002,28(9)：69-72.

[6] 周幗萍,汪芳安,高 冰.木瓜醋的研制[J].中國釀造、2005(3)：56-58.

[7] 周幗萍,汪芳安,張佑平.木瓜復(fù)合果醋的釀制 [J].食品科學(xué)、2005(10)：274-276.

[8] 王蕊,高 翔.木瓜保健果醋的工藝研究[J].中國釀造、2004(8)：35-37.

[9] 董永勝,劉同軍,賈士儒.紅曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K工藝條件的研究 [J].食品研究與開發(fā),2007(6)：27-30.

[10] 周幗萍,汪芳安,高 冰.醋酸菌篩選培養(yǎng)基的優(yōu)化和優(yōu)良醋酸菌的分離[J].中國釀造,2004,(6)：18-19.

[11] 包啟安.食醋科學(xué)與技術(shù) (第一版)[M].北京：科學(xué)普及出版社,1999：375-380.

[12] 王福源.現(xiàn)代食品發(fā)酵技術(shù) [M].北京：中國輕工業(yè)出版社,1998：506-556.