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        綿羊FGF5基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

        2011-01-11 02:56:20劉伍限賈斌石國(guó)慶
        關(guān)鍵詞:表位綿羊抗原

        劉伍限,賈斌,石國(guó)慶,2

        (1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,石河子832003;2新疆農(nóng)墾科學(xué)院,石河子832000)

        利用生物信息學(xué)分析基因和蛋白質(zhì)的序列模式,不僅可以對(duì)基因的分子進(jìn)化和相似性進(jìn)行研究,也可以進(jìn)一步研究基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。

        本實(shí)驗(yàn)將克隆獲得的綿羊FGF5基因,借助生物信息學(xué)手段,對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行了蛋白理化特性、氨基酸序列以及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),以期為進(jìn)一步研究FGF5基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)與調(diào)控及生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        Taq DNA聚合酶和pMDTM18-T Vector購(gòu)自TaKaRa公司,dNTP(s),PCR引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成,DL2000DNA Ladder購(gòu)自天根公司,感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)購(gòu)自美國(guó)Novagen公司,大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

        1.2 方法

        1.2.1 引物的設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

        參照牛FGF5基因(NM_001078011),并運(yùn)用軟件Primer 2.0在其保守性區(qū)域設(shè)計(jì)引物,上游引物為 5′-ATGAGCTTGTCCTTCCTCCT-3′,下 游 引物為5′-TTAACCAAAGCGAAACTTGA-3′,引物送于北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。以綿羊皮膚組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,克隆得到目的基因。PCR擴(kuò)增程序如下:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,60℃復(fù)性30s,72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。

        1.2.2 FGF5基因的克隆和測(cè)序

        將PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳并回收,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化連接到pMD18-T載體上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a,酶切鑒定后由北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交網(wǎng)站比對(duì),以檢測(cè)是否為需要的序列。

        1.2.3 序列分析

        利用Vector NTI Suite 8中ORF finder確定其完整編碼區(qū)(CDS)獲得其正確氨基酸編碼序列;運(yùn)用蛋白在線分析工具及軟件對(duì)該蛋白進(jìn)行各級(jí)結(jié)構(gòu)及特征分析:采用 ProtParam(http://au.expasy.org/cgi-bin/protparam)程序,預(yù)測(cè) FGF5蛋白分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì);采用SOSUI(http://bp.nuap.nagoya-u.a(chǎn)c.jp/sosuil/)程序,分析 FGF5蛋白的可溶性;采用DNAMAN軟件,分析FGF5蛋白的親(疏)水性,并預(yù)測(cè)其親水性高的區(qū)域;采用MotifScan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)程序,預(yù)測(cè)蛋白的翻譯后修飾位點(diǎn);采用TMH-MM2.0服務(wù)器對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜分析;利用SignalP 3.0系統(tǒng)預(yù)測(cè)FGF5蛋白的信號(hào)肽序列;通過TargetP 1.1和PSORTⅡprediction在線軟件進(jìn)行綿羊FGF5蛋白的細(xì)胞定位分析;采用HNN軟件 (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl),分析FGF5蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu);通過Gene Runner軟件和DNAMAN軟件,分析FGF5蛋白潛在的抗原表位,預(yù)測(cè)其免疫原性。

        當(dāng)然,簡(jiǎn)約的課堂,不僅是學(xué)情了解、教學(xué)目標(biāo)、教學(xué)主線、教學(xué)結(jié)構(gòu)、教學(xué)方法、教學(xué)評(píng)價(jià)上的簡(jiǎn)約,還包括了簡(jiǎn)練的教學(xué)語言、精致的教學(xué)練習(xí)、簡(jiǎn)易的教學(xué)手段、適當(dāng)?shù)拿浇閼?yīng)用等。簡(jiǎn)約不是簡(jiǎn)單的刪減,是“豪華落盡見真淳,鉛華洗卻見本色”的濃縮,是“三言兩語是精華,一枝一葉總關(guān)情”。課堂的高效理應(yīng)從簡(jiǎn)約開始!

        2 結(jié)果與分析

        2.1 綿羊FGF5基因cDNA的克隆

        根據(jù)牛的同源保守區(qū)域,并運(yùn)用Primer 2.0在其同源性高的區(qū)域設(shè)計(jì)引物,以綿羊皮膚cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到1條813bp的目的條帶(圖1),經(jīng)克隆、酶切鑒定和測(cè)序、BLAST比對(duì)確定為綿羊FGF5基因cDNA序列。

        圖1 綿羊FGF5基因片段的克隆Fig.1Cloning of FGF5gene in sheep

        2.2 FGF5蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

        綿羊FGF5基因所編碼的蛋白由270個(gè)氨基酸組成(圖2),其氨基酸組成中亮氨酸的含量高達(dá)14.8%,遠(yuǎn)高于其它氨基酸的含量。其分子質(zhì)量單位為29.584 7ku,分子式為C1315H2085N389O378S6,等電點(diǎn)理論值為10.59,含有4個(gè)半胱氨酸,假設(shè)形成2個(gè)二硫鍵,則其在水溶液中摩爾消光系數(shù)為25565M-1cm-1,0.1%濃度(1g/L)的 Abs為0.864,當(dāng)二硫鍵全部打開時(shí),對(duì)應(yīng)值分別為25440M-1cm-1和0.860。成熟蛋白N端為蛋氨酸時(shí),預(yù)測(cè)半衰期值哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞體外表達(dá)當(dāng)中為30h,酵母和大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)分別大于20h和10h。在溶液當(dāng)中不穩(wěn)定指數(shù)為56.83,高于閾值40,為不穩(wěn)定蛋白。

        圖2 FGF5基因預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig.2The predicted amino acid sequence of FGF5gene

        2.3 FGF5蛋白的可溶性和親(疏)水性

        FGF5蛋白的平均親水性系數(shù)為-0.55,為可溶性蛋白。采用DNAMAN軟件分析,F(xiàn)GF5蛋白具有多個(gè)親水性高的區(qū)域(圖3)。

        圖3 FGF5蛋白的親/疏水性Fig.3Hydrophilic and hydrophobic profile of the protein of FGF5

        2.4 FGF5翻譯后修飾和結(jié)構(gòu)特征序列

        通過翻譯后修飾位點(diǎn)分析,理論推測(cè)該蛋白含有7個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn),分別為:1個(gè)酰胺化位點(diǎn)(86~89位氨基酸)、1個(gè) ASN-糖基化位點(diǎn)(112~115位氨基酸)、1個(gè)環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥苷依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(47~50位氨基酸)、4個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(74~77位氨基酸,121~124位氨基酸,186~189位氨基酸,234~237位氨基酸)、5個(gè)豆蔻酰化位點(diǎn)(42~47位氨基酸,70~75位氨基酸,91~96位氨基酸,113~118位氨基酸,137~142位氨基酸)、9個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(37~39位氨基酸,45~47位氨基酸,86~88位氨基酸,140~142位氨基酸,147~149位氨基酸,155~157位氨基酸,183~185位氨基酸,186~188位氨基酸,260~262位氨基酸)、1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(167~173位氨基酸)。

        2.5 綿羊FGF5蛋白的跨膜分析

        TMH-MM2.0服務(wù)器對(duì)綿羊FGF5蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4所示,顯示存在2個(gè)跨膜區(qū),表明綿羊FGF5編碼蛋白是跨膜蛋白。

        圖4 TMHMM 2.0服務(wù)器對(duì)綿羊FGF5蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)Fig.4Prediction of transmembrane domains(arrows indicated)of FGF5protein by using TMHMM 2.0server

        2.6 FGF5蛋白的信號(hào)肽分析

        經(jīng)SignalP 3.0預(yù)測(cè)FGF5蛋白的信號(hào)肽序列,結(jié)果見圖5。由圖5可知,綿羊FGF5蛋白前20個(gè)氨基酸組成一段信號(hào)肽,信號(hào)肽裂解點(diǎn)位于第20位氨基酸Ala與第21位氨基酸Gln之間。

        圖5 綿羊FGF5蛋白的信號(hào)肽分析Fig.5Analysis of the signal peptide in sheep FGF5

        2.7 綿羊FGF5蛋白的細(xì)胞定位分析

        利用TargetP 1.1和PSORTⅡprediction分析綿羊FGF5蛋白的細(xì)胞定位,結(jié)果(表1)表明,綿羊FGF5蛋白主要集中在分泌途徑上,線粒體中很少,說明該蛋白應(yīng)屬于分泌型蛋白。綿羊FGF5蛋白主要分布在細(xì)胞內(nèi)部,包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體,只有少數(shù)分布在細(xì)胞外。

        表1 綿羊FGF5蛋白亞細(xì)胞定位分析Tab.1Predicts the subcellular location of sheep FGF5

        2.8 FGF5蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

        預(yù)測(cè)FGF5蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由270個(gè)氨基酸組成,其中70個(gè)氨基酸(占25.93%)可能形成α螺旋(藍(lán)色),23個(gè)氨基酸(8.52%)可能形成延伸鏈(紅色),177個(gè)氨基酸(占65.56%)可能形成無規(guī)卷曲(紫色),沒有形成β折疊片。由此可知該蛋白質(zhì)主要以α螺旋及無規(guī)則卷曲為主。

        圖6 FGF5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6secondary structure prediction of the FGF5protein

        2.9 綿羊FGF5蛋白抗原表位

        抗原表位是指能與抗體特異性結(jié)合的、位于抗原分子表面具有特殊結(jié)構(gòu)的化學(xué)基團(tuán),也稱為抗原決定簇。杰弗森-沃夫(Jameson-Wolf)抗原指數(shù)是GeneRunner軟件聯(lián)合運(yùn)用 Hoop-Woods、Karplus、Emini、Chou-Fasman和 Robson-Garnier方法,結(jié)合表面概率、鏈柔韌性、親水性及二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息,預(yù)測(cè)蛋白的抗原表位。綿羊FGF5蛋白的抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果見圖7。

        用DNAMAN軟件對(duì)FGF5蛋白的氨基酸序列中潛在的抗原表位作進(jìn)一步分析,顯示有11個(gè)潛在抗原表位(表2)。

        圖7 FGF5蛋白的抗原表位分析Fig.7Analysis of the antigenic index of FGF5protein

        表2 FGF5氨基酸序列中11個(gè)潛在抗原表位Tab.2 11potential epitopes of amino acid sequence of FGF5

        3 討論

        生物信息學(xué)作為近年來發(fā)展迅速的一門生物學(xué)科,已經(jīng)廣泛應(yīng)用在預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能以及確定蛋白質(zhì)生物學(xué)特性等研究領(lǐng)域。本文通過運(yùn)用蛋白在線分析工具及軟件等生物信息學(xué)手段根據(jù)綿羊FGF5基因序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)可能的結(jié)構(gòu)[8]和抗原表位[9]。研究發(fā)現(xiàn)綿羊FGF5基因CDS序列全長(zhǎng)為813bp,編碼蛋白由270個(gè)氨基酸組成,前面20位氨基酸序列是一段信號(hào)肽,這與高愛琴等[10]對(duì)山羊FGF5蛋白的分析相似,這也是FGF家族的共同特性,說明FGF5蛋白的N末端具有典型的信號(hào)序列分泌蛋白,其通過信號(hào)肽引導(dǎo)從蛋白合成部位移到細(xì)胞膜壁,最后分泌到胞外。以此推測(cè)FGF5基因是以旁分泌形式作用于靶細(xì)胞。

        預(yù)測(cè)蛋白序列中跨膜螺旋的位置是當(dāng)前生物信息學(xué)中重要的研究課題,因?yàn)橥ㄟ^對(duì)膜蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)能為該蛋白的功能研究提供重要線索。分析發(fā)現(xiàn)綿羊FGF5基因編碼蛋白存在2個(gè)可能的跨膜區(qū),這就為配體的特異性結(jié)合提供了受體的分子基礎(chǔ),其具體生物學(xué)功能有待進(jìn)一步研究。通常,轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域決定蛋白質(zhì)的功能,轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)是比較松散的結(jié)構(gòu),易于發(fā)生扭曲、盤旋并展示在蛋白的表面,該區(qū)域常含B細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)抗原表位[11]。綿羊FGF5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示以α螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主,指示該蛋白屬混合型蛋白[12],該區(qū)域抗原指數(shù)較高,該區(qū)段的抗原表位應(yīng)該是優(yōu)勢(shì)抗原表位所在,通過DNAMAN軟件分析我們得知該蛋白具有11個(gè)抗原表位。而抗原表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ),我們可以根據(jù)分析結(jié)果正確詳細(xì)地繪制蛋白質(zhì)抗原表位的圖譜,為下一步研究抗體可變區(qū)的功能、提高抗體的親和力、設(shè)計(jì)抗原和抗體提供理論基礎(chǔ)。

        目前對(duì)FGF5蛋白的結(jié)構(gòu)研究還比較少,本實(shí)驗(yàn)在成功克隆FGF5基因CDS片段的基礎(chǔ)上,對(duì)綿羊FGF5蛋白進(jìn)行了理化性質(zhì)、信號(hào)態(tài)、跨膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及抗原表位等進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析,這就為進(jìn)一步闡明FGF5基因在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制提供了線索。

        [1]Pennycuik P R,Raphael K A.The angora locus(go)in the mouse:hair morphology,duration of growth cycle and site of action[J].J Clin Invest,1999,104(7):855-864.

        [2]Hebert J M,Rosenquist T,Gotz J.FGF5as a regulator of the hair growth cycle:evidence from targeted and spontaneous mutations[J].Cell,1994,78:1017-1025.

        [3]Suzuki S,Kato T,Takimoto H.Localization of rat FGF5 protein in skin macrophage-like cells and FGF5Sprotein in hair follicle:possible involvement of two FGF5gene products in hair grotwh cycle regulation[J].J Invest Dermatol,1998,111(6):963-972.

        [4]Ito C,Saitoh Y,F(xiàn)ujita Y.Decapeptide with fibroblast growth factor(FGF)-5partial sequence inhibits hair growth suppressing activity of FGF5[J].J Cell Physiol,2003,197(2):272-283.

        [5]Suzuki S,Ota Y,Ozawa K.Dual-mode regulation of hair growth cycle by two FGF5gene products[J].J Invest Dermatol,2000,114(3):456-463.

        [6]高愛琴,李寧,趙興波,等.不同綿羊品種FGF5基因的多態(tài)性分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,37(4):326-330.

        [7]Pennycuik P R,Raphael K A.The angora locus(go)in the mouse:hair morphology,duration of growth cycle and site of action[J].Journal of Clinical Investigation,1999,104(7):855-864.

        [8]郝柏林,張淑譽(yù).生物信息學(xué)手冊(cè)[M].上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社,2002:250-256.

        [9]Korber B,LaBute M,Yusim K.Immunoinformatics comes of age[J].Plos Computational Biology,2006,2(6):484-92.

        [10]高愛琴,李 寧,李金泉,等.山羊FGF5基因cDNA分子克隆及序列分析[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào),2006,37(2):180-184.

        [11]Blythe M,F(xiàn)lower D.Benchmarking B cell epitope prediction:underperformance of existing methods[J].Protein Sci,2005,14:1246-1248.

        [12]Skolnick J,F(xiàn)etrow J S.From genes to protein structure and function:novel applications of computational approaches in the genomic era[J].Trends in Biotechnology,2000,18(1):34-39.

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