黎小正, 童桂香, 韋信賢, 吳祥慶, 陳 康

(1. 廣西漁業(yè)病害防治環(huán)境監(jiān)測和質(zhì)量檢驗中心, 廣西 南寧 530021; 2. 欽州市欽南區(qū)水產(chǎn)畜牧局, 廣西 欽州535000)

香港巨牡蠣ISSR-PCR反應體系的建立及優(yōu)化

黎小正1, 童桂香1, 韋信賢1, 吳祥慶1, 陳 康2

(1. 廣西漁業(yè)病害防治環(huán)境監(jiān)測和質(zhì)量檢驗中心, 廣西 南寧 530021; 2. 欽州市欽南區(qū)水產(chǎn)畜牧局, 廣西 欽州535000)

以香港巨牡蠣(Crassostrea hongkongensis)基因組DNA為模板, 采用正交設計及單因素比較試驗,分別對Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和DNA模板濃度的PCR原料進行優(yōu)化, 并通過溫度梯度PCR, 篩選適宜的退火溫度。確立了香港巨牡蠣的最適ISSR-PCR反應體系： 25 μL反應體系中含PCR 1×Buffer, 2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、0.2 μmol/L 引物、1.2 UTaqDNA 聚合酶、20 ng DNA模板。反應程序為： 94℃預變性5 min; 94℃變性1 min, 48～54℃(隨引物而確定)退火1 min, 72℃延伸1.5 min, 35個循環(huán); 72℃延伸10 min。利用所建立的 ISSR-PCR反應體系對香港巨牡蠣基因組DNA進行擴增, 獲得了清晰、重復性好、多態(tài)性高的DNA譜帶, 為進一步利用ISSR分子標記研究香港巨牡蠣的遺傳多樣性奠定了基礎。

香港巨牡蠣(Crassostrea hongkongensis); ISSR-PCR; 體系優(yōu)化

香港巨牡蠣 (Crassostrea hongkongensis), 屬于雙殼綱(Bivalvia), 珍珠貝目(Pteriodae), 牡蠣科(Ostreidae)[1], 俗稱大蠔, 是暖水性雙殼類軟體動物,以濾食海水浮游生物為主, 其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富,素有“海底牛奶”之稱, 是中國南方沿海主要的經(jīng)濟貝類和出口海產(chǎn)品, 也是作為海洋重金屬等污染的重要指示生物[2]。欽州灣海岸曲折、咸淡水交匯、灘涂廣闊、十分有利于牡蠣的繁殖和生長, 茅嶺海域也因產(chǎn)上乘品質(zhì)的牡蠣而被農(nóng)業(yè)部授予“中國牡蠣之鄉(xiāng)”的榮譽稱號。欽州市的牡蠣養(yǎng)殖逐年增多, 苗種采集及成品產(chǎn)量大幅增長, 隨著人工開發(fā)和自然環(huán)境的變化, 香港巨牡蠣的生長發(fā)生了一些變化, 甚至出現(xiàn)種質(zhì)退化和變異現(xiàn)象[3]。因此, 研究欽州香港巨牡蠣種質(zhì)資源的遺傳多樣性和群體遺傳結構變異,對充分開發(fā)利用及保護資源具有重要意義。目前, 對于研究牡蠣遺傳多樣性的分子標記方法主要有RAPD分析、線粒體DNA基因片段分析、微衛(wèi)星標記及同工酶帶型分析等[4-6]。簡單重復序列間擴增(inter simple sequence repeat, ISSR )是近年來在微衛(wèi)星技術的基礎上發(fā)展起來的一種新型分子標記技術,具有操作簡單、重復性好, 多態(tài)性高、適合大樣本基因組DNA的檢測等優(yōu)點[7], 且ISSR為顯性標記, 具有孟德爾遺傳特征, 因此被廣泛地應用于各種生物的遺傳多樣性分析、品種和種質(zhì)鑒定以及物種和種群親緣關系等方面研究。但由于 ISSR標記是基于PCR的反應, 其擴增結果易受Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物、模板 DNA等因素的影響, 且最佳擴增條件因被測物種不同而各有不同。本研究采用正交設計及單因素比較試驗對香港巨牡蠣ISSR-PCR反應體系進行優(yōu)化, 建立香港巨牡蠣的最適ISSR-PCR反應體系, 為欽州牡蠣主要養(yǎng)殖品種香港巨牡蠣的種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性分析提供分子標記方法。

1 材料與方法

1.1 材料

香港巨牡蠣采自欽州茅尾海域, 活體低溫運回實驗室解剖取閉殼肌, -80℃保存。

1.2 主要試劑

ISSR引物參考加拿大哥倫比亞大學(University of British Columbia, UBC)公布的 100條引物序列,參照文獻[8-10]的研究結果選取其中的 25條引物進行試驗, 編號分別為 810, 811、812、813、814、815、822、823、824、828、829、830、835、840、841、842、843、844、845、852、853、854、855、856、857, 各引物均為二核苷酸重復堿基。PCRPremix Taq、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司。

1.3 DNA提取

每個牡蠣樣取閉殼肌50 mg剪碎, 加600 μL細胞裂解液振蕩混勻; 加蛋白酶 K消化過夜, 依次用酚、氯仿抽提, 最后加無水乙醇沉淀 DNA, 干燥后加超純水100 μL溶解。紫外分光光度計測DNA濃度和純度, 稀釋成20 μg/mL, －20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物初次篩選

用PCRPremix Taq反應液將25條引物初步篩選,參照相關文獻[11], ISSR-PCR反應體系為： 25 μL中含 2×PCR Mix 12.5 μL, 引物(10 μmol/L)1 μL, 模板20 ng, 加水補足25 μL。PCR反應程序為94℃預變性5 min; 94℃變性1 min, 52℃退火1 min, 72℃延伸1.5 min, 進行35個循環(huán); 72℃延伸10 min。15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測結果, 選取擴增條帶清晰、多態(tài)性好的引物作下一步優(yōu)化實驗。從25條引物中篩選,擴增較理想的是823(TCT CTC TCT CTC TCT CC)。

1.5 篩選引物最佳退火溫度的確定

將擴增條帶清晰的引物823作溫度梯度PCR試驗, 反應體系參照1.4, 退火溫度分別設為48、50、52、54、56、58℃, 電泳檢測結果, 確定該引物的最佳退火溫度。經(jīng)檢測, 823的最佳退火溫度為50℃。

1.6 ISSR-PCR反應體系的優(yōu)化

參照已發(fā)表文獻中的ISSR- PCR反應體系[12-13],用引物823進行香港巨牡蠣ISSR- PCR體系的優(yōu)化,對 Mg2+濃度(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L)、dNTPs(0.1、0.14、0.20、0.26、0.30 mmol/L)、引物(0.1、0.14、0.20、0.26、0.30 μmol/L)、Taq酶(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 U)、模板(10、20、30、40、50 ng)5個因素水平用正交設計L25(55)進行試驗(表1), 設置25個不同組合, 反應體系均為25 μL, 按表1各反應因子終濃度加樣; PCR反應程序參照 1.4, 結束后經(jīng)15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶數(shù)目及清晰度得到理想的濃度組合, 再逐一進行單個因素試驗。

1.7 各單個因子濃度梯度試驗

在利用引物 823確定了最佳組合的基礎上, 分別對5種因子的不同濃度水平進行ISSR-PCR, 設置Mg2+濃度分別為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mmol/L 9個梯度; dNTPs濃度分別為0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22、0.24、0.26、0.28 mmol/L 10個梯度; 引物濃度分別為0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22、0.24、0.26、0.28、0.30 μmol/L 11 個梯度;Taq酶分別為 0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8U 13個梯度; 模板DNA含量分別為10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ng 共11個梯度。比較各因素在不同濃度時的擴增效果, 獲得最佳的ISSR-PCR反應體系。

1.8 其余引物篩選

取香港巨牡蠣DNA樣品用優(yōu)化后的反應體系對其余24條引物進行篩選, 并通過溫度梯度PCR(退火溫度為48、50、52、54、56、58℃)探索每條引物的最佳退火溫度, 最終篩選到擴增條帶清晰, 多態(tài)性好的引物及其適宜的退火溫度。

1.9 優(yōu)化體系的應用

隨機選取 24份香港巨牡蠣閉殼肌提取基因組DNA, 利用優(yōu)化建立的體系進行 ISSR-PCR, 電泳檢測結果, 驗證 ISSR-PCR體系對香港巨牡蠣的適用性。

2 試驗結果

2.1 初次引物篩選結果

將25條引物初步篩選, 結果引物823擴增條帶較理想(圖1), 可以擴增到5條較清晰、便于觀察的條帶, 因此, 選擇823進行ISSR-PCR反應體系的優(yōu)化。

2.2 引物823的最佳退火溫度

經(jīng)溫度梯度 PCR試驗, 823的最佳退火溫度是50℃。

2.3 ISSR- PCR正交試驗結果

Mg2+、dNTPs、引物、DNA模板濃度及TaqDNA聚合酶量等各反應因素的綜合作用影響PCR的擴增,正交設計的ISSR-PCR試驗結果(圖2)顯示各組合的擴增結果差異明顯, 通過比較可篩選到較理想的各反應因子濃度組合。電泳顯示第8組合效果最好, 其TaqDNA聚合酶量高, 擴增條帶清晰; 第1、4、5、22、23號組合都沒有擴增, 2、3、9號顯示微弱擴增

帶。因此選擇 8號組合(含有 1.5 mmol/L Mg2+、0.20 μmol/L dNTPs、0.26 μmol/L引物、2.5 UTaqDNA聚合酶、10 ng DNA模板)為香港巨牡蠣ISSR-PCR的較適反應體系組合。

表1 香港巨牡蠣ISSR-PCR反應L25(55)正交試驗設計Tab. 1 Orthogonal design L25(55)of ISSR-PCR in Crassostrea hongkongensis

圖1 25條ISSR引物的PCR結果Fig. 1 ISSR-PCR results of 25 primers

圖2 香港巨牡蠣ISSR-PCR反應L25(55)正交試驗結果Fig. 2 Orthogonal design L25(55)results of ISSR-PCR in Crassostrea hongkongensis

2.4 各單因子對擴增結果影響

2.4.1 Mg2+濃度

當 Mg2+終濃度依次為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mmol/L時均有擴增(圖 3), 濃度為 0.5mmol/L時只有兩條擴增帶, 高于 2.5 mmol/L時大片段的非特異性帶較多, 而濃度為 2.5 mmol/L時擴增條帶數(shù)目適中、清晰, 因此確定 Mg2+的終濃度為2.5mmol/L。

2.4.2 dNTPs濃度

dNTPs濃度分別為 0.1、0.12、0.16、0.18、0.20、0.22、0.24 mmol/L時都有擴增, 濃度為0.26 mmol/L只有微弱的擴增帶, 濃度為 0.14 mmol/L 和0.28 mmol/L無擴增帶(圖4)。由圖可知, dNTPs終濃度為0.20 mmol/L時效果最好。

圖3 Mg2+濃度對ISSR-PCR影響Fig. 3 Effect of different concentrations of Mg2+

圖4 dNTPs濃度對ISSR-PCR影響Fig. 4 Effect of different concentrations of dNTPs

2.4.3 引物濃度

引物濃度在 0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22、0.24、0.26、0.28、0.30 μmol/L 10個梯度時都有擴增,引物濃度過低(0.1 μmol/L)無擴增產(chǎn)物, 引物濃度過高(0.28、0.30 μmol/L)擴增效率低, 引物濃度為0.20 μmol/L時可得到較理想的結果(圖5)。

2.4.4 Taq酶

圖5 引物濃度對ISSR-PCR影響Fig. 5 Effect of different concentrations of primer

TaqDNA聚合酶共設置了0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8 U 的 13個梯度, 每個濃度均可得到較清晰的擴增產(chǎn)物, 但低濃度時效率相對低, 擴增條帶弱, 隨著酶的增加,擴增效率提高, 但酶的濃度過高使擴增的檢測結果背景較重, 增加了成本, 當TaqDNA聚合酶為1.2 U時即可獲得較好效果(圖6)。

圖6 Taq DNA聚合酶對ISSR-PCR影響Fig. 6 Effect of different concentrations of Taq DNA polymerase

2.4.5 模板濃度影響

DNA 模板分別為 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ng 時均有擴增(圖 7), 低濃度 DNA(10、15 ng)時擴增效率很低, 不易觀察; 20 ng DNA即可得到較好效果, 將 DNA濃度增大, 其擴增產(chǎn)物無明顯差異, 因此, 本反應體系應加入20ng模板。

圖7 模板濃度對ISSR-PCR影響Fig. 7 Effect of different concentrations of DNA

2.5 香港巨牡蠣ISSR-PCR的最佳反應體系

經(jīng)過正交試驗設計及各單因子濃度探索, 確定香港巨牡蠣 ISSR-PCR分析技術的最佳反應體系為：25 μL的反應體系含有Mg2+濃度2.5 mmol/L、dNTPs濃度0.20 mmol/L、引物濃度0.20 μmol/L、TaqDNA聚合酶1.2 U、模板DNA 20 ng; 擴增程序為： 94℃5 min; 94℃ 1 min, 退火(48～56℃)1 min, 72℃延伸l.5 min, 35個循環(huán); 72℃延伸10 min, 4℃結束反應。

2.6 引物篩選結果

按ISSR-PCR最佳反應體系對引物進行篩選, 結果從25條引物中篩選到9條擴增條帶清晰、重復性較好, 顯帶強的引物(表 2)。根據(jù)各引物的解鏈溫度(Tm), 對每一個引物在(Tm±5)℃的范圍內(nèi)進行溫度梯度 PCR, 引物的退火溫度對擴增結果影響不大,優(yōu)化后得到9個引物的最佳退火溫度值, 因Tm值不同, 其最佳退火溫度也不盡相同, 在48～54℃之間。

2.7 優(yōu)化體系的應用

利用優(yōu)化建立的體系將篩選的引物應用于香港巨牡蠣基因組ISSR-PCR, 驗證該體系的適用性。圖8是其中一條引物對隨機選取的24份香港巨牡蠣閉殼肌DNA擴增結果, 電泳顯示該反應具有較清晰的擴增帶。

3 討論

ISSR-PCR對不同引物、不同材料的擴增條件存在較大差異, 并受諸多因素影響, 如 DNA模板的濃度與純度、dNTPs、Mg2+的濃度、TaqDNA聚合酶用量、退火溫度和反應程序等[14], 并且各反應因子的相互影響直接關系到ISSR-PCR結果。正交試驗是研究多因素多水平的一種方法, 具有均衡分散和整齊可比的特點, 在ISSR-PCR反應的各因素評價中正交試驗顯示了其優(yōu)越性[15]。本試驗以香港巨牡蠣基因組 DNA為模板, 利用正交試驗設計方法, 得到了香港巨牡蠣的 ISSR-PCR較佳反應體系組合; 并以此為基礎, 對各反應因子逐個優(yōu)化, 探索各因子的最佳反應濃度。

影響ISSR-PCR反應的因素多, Mg2+濃度影響反應的特異性和擴增效率, 通常 Mg2+終濃度在 1.0～2.5 mmol/L之間可得到較好的結果, 高濃度的Mg2+能提高擴增效率, 但是 Mg2+過高電泳帶會有明顯的背景且會降低反應的特異性[16], 因此, 在兼顧擴增效率情況下應適當降低 Mg2+濃度。本試驗中 Mg2+終濃度設置了 0.5～4.5 mmol/L的梯度, 各濃度均有擴增帶, 但濃度為 0.5 mmol/L時只有兩條擴增帶,顯然低濃度 Mg2+影響了整個反應的擴增效果, 而高于2.5 mmol/L時大片段的非特異性帶較多, Mg2+濃度為2.5 mmol/L時擴增條帶數(shù)目適中、清晰。dNTPs濃度一般在0.02～0.20mmol/L之間, 其濃度過高會導致聚合酶錯誤的摻入, 濃度過低又會影響合成效率,甚至會因 dNTPs過早耗盡而使產(chǎn)物單鏈化, 影響擴增效果; 本試驗中dNTPs濃度為0.2 mmol/L時效果最佳, dNTPs濃度過高反應無擴增, 可能是由于高濃度dNTPs分子中的磷酸基團能與Mg2+結合, 使有效反應的Mg2+減少, 反應受到抑制。引物濃度對 PCR反應起重要作用, 濃度過低時結合幾率小而擴增效率降低, 濃度過高可能導致錯配, 特異性降低, 并可能導致引物二聚體形成; 本試驗中引物 0.1 μmol/L無擴增產(chǎn)物, 表明過低的引物濃度無法得到擴增產(chǎn)物, 而過高的引物濃度(0.28、0.30 μmol/L)時擴增產(chǎn)物帶不清晰、效率低, 可能是由于高濃度的引物抑制了反應體系中其他因子的有效作用, 當引物濃度為0.20 μmol/L時可得到較理想的結果。高濃度TaqDNA聚合酶增加成本和非特異擴增產(chǎn)物, 低濃度可能使酶催化能力不夠強而影響產(chǎn)物的合成效率,Taq酶的用量一般在0.5～5 U之間, 此試驗中隨著Taq酶量的增加, 擴增效率提高的同時伴有帶型變得模糊、大片段的非特異性產(chǎn)物增多, 故 25 μL體系中使用1.2 U即可。ISSR-PCR反應對模板濃度要求不嚴格[17],但是濃度過高和過低都會影響到擴增反應的效率和特異性。從本試驗模板濃度的影響結果看, DNA濃度對反應的影響較其他因子小, 在10～60 ng均有擴增,低濃度DNA影響PCR效率, 擴增帶少, 隨著DNA濃度的增加, PCR結果差異不大, 25 μL反應體系中DNA含量20 ng即可獲得較好效果。此外, 本實驗根據(jù)篩選到的各引物的解鏈溫度(Tm), 在(Tm±5)℃的范圍內(nèi)對各引物的最佳退火溫度進行確定, 因各引物的Tm值不同, 其最佳退火溫度也不盡相同, 在48～54℃之間, 一般在52℃即可獲得較好的效果。

表2 從25條引物中篩選的9條ISSR-PCR引物Tab. 2 Nine satisfactory ISSR-PCR primers to Crassostrea hongkongensis selected out of 25 candidates

圖8 引物823在優(yōu)化后的體系下對24份香港巨牡蠣DNA樣品的擴增結果Fig. 8 ISSR-PCR results of 24 Crassostrea hongkongensis DNA amplified by the optimized reaction system

綜合以上試驗, 篩選出適合香港巨牡蠣的ISSR-PCR最佳反應體系為： 25 μL的反應體積中含10×Buffer 2.5 μL, 2.5 mmol/L Mg2+、0.20 mmol/L dNTPs、0. 20 μmol/L引物、1.2 UTaqDNA聚合酶、20 ng DNA模板; 反應程序為： 94℃預變性 5 min;94℃變性 1 min, 48～54℃退火 1 min, 72℃延伸 1.5 min, 35個循環(huán); 72℃延伸 10 min, 4℃結束反應。試驗表明, 利用所建立的 ISSR反應體系對香港巨牡蠣基因組DNA進行PCR擴增, 可獲得清晰、重復性好、多態(tài)性高的 DNA譜帶, 為進一步利用ISSR分子標記技術進行香港巨牡蠣遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源鑒定等研究奠定了基礎。

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Establishment and optimization of an ISSR-PCR reaction system forCrassostrea hongkongensis

LI Xiao-zheng1, TONG Gui-xiang1, WEI Xin-xian1, WU Xiang-qing1, Chen Kang2
(1. Center of Disease Prevention and Cure, Environmental Monitoring and Quality Monitoring of Guangxi Fishery,Nanning 530021, China; 2. Qinnan Fisheries and Husbandry Bureau of Qinzhou, Qinzhou 535000,China)

Dec., 23, 2010

Crassostrea hongkongensis; ISSR-PCR; reaction system optimization

To establish an ISSR-PCR reaction system inCrassostrea hongkongensis, the factors influencing ISSR-PCR system were explored with the orthogonal design and main parameters comparison test, based on the genomic DNA ofC. hongkongensis. The optimized ISSR-PCR system (25 μL) was determined as follows：1×Buffer, 2.5 mmol/L Mg2+, 0.2 mmol/L dNTPs, 0. 2 μmol/L primer, 1.2 UTaqDNA polymerase, and 20 ng DNA template. The reaction program included an initial denaturation for 5 minutes at 94℃, 35 cycles of denaturation for 1 minutes at 94℃, annealing for 1 minutes at 48～54℃, extension for 1.5 minutes at 72℃, and a final extension of 10 minutes at 72℃. The clear, reproducible, polymorphic products were obtained by the established ISSR-PCR reaction system. The results lay a foundation for the analysis of genetic diversity ofC.hongkongensisby ISSR marker.

S968

A

1000-3096(2011)08-0018-07

2010-12-23;

2011-03-15

廣西科技攻關項目(0992015-1)

黎小正(1962-), 男, 廣東陽春人, 高級工程師, 碩士, 主要從事水產(chǎn)品的檢驗檢疫和漁業(yè)環(huán)境保護等方面的研究, E-mail：lixz@tom.com; 韋信賢, 通訊作者, E-mail： Byang15@126.com

梁德海)