姚曉峰 張 侖 張 強(qiáng) 曹曉莉

細(xì)針吸細(xì)胞學(xué)檢查(FNAB)是甲狀腺癌診斷和鑒別診斷的常用方法，它操作簡單、安全、快捷，并且具有較高的特異性和準(zhǔn)確率。但是，F(xiàn)NAB也有一定的局限性和缺陷，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不明顯或取材不當(dāng)而導(dǎo)致無法明確診斷，在臨床應(yīng)用中受到一定的限制。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，檢測甲狀腺細(xì)針吸組織中TMPRSS4和onfFN mRNA的表達(dá)量，并探討其與FNAB聯(lián)合對(duì)甲狀腺癌診斷和鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

收集天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2006年1月至2007年7月。甲狀腺細(xì)針吸標(biāo)本78例，其中術(shù)后病理檢查證實(shí)為甲狀腺癌45例，其中乳頭狀癌29例，濾泡癌9例，髓樣癌5例，未分化癌2例；男性18例，女性27例，年齡8～79歲，平均年齡48.5歲。甲狀腺良性病變33例，其中結(jié)節(jié)性甲狀腺腫16例，腺瘤13例，橋本氏甲狀腺炎4例；男性13例，女性20例，年齡16～72歲，平均年齡44歲。所有病例均行超聲引導(dǎo)下的細(xì)針吸細(xì)胞學(xué)檢查，其中一部分標(biāo)本用于涂片后細(xì)胞學(xué)檢測，另一部分放入裝有TRIzol試劑試管內(nèi)，然后在-80℃的冰箱內(nèi)凍存。

1.2 熒光定量RT-PCR

TRIzol法提取甲狀腺細(xì)針吸標(biāo)本的RNA，微量核酸檢測儀測定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳判斷提取RNA的質(zhì)量。引物與探針的設(shè)計(jì)采用Oligo 6.0軟件。TMPRSS4的引物和探針：Forward5′- CTG，CCT，TGG，GGT，GAC，AAT，CT-3′，Reverse5′- CAT，CGA，GGC，TGT，TCA，GAG，GTT-3′，Probe5′(FAM)- GGG，AGG，ATC，ACA，GAG，CCA，GCA，TGT，T-3′(TAMRA)。onfFN的引物和探針：Forward5′- GAG，GTG，CCA，CCT，ACA，ACA，TCA，TA -3′，Reverse5′- AGG，GGT，CAA，AGC，ACG，AGT，CAT-3′，Probe5′(FAM)- ACC，GTG，GGC，AAC，TCT，GTC，AAC，GAA，G -3′(TAMRA)。GAPDH的引物和探針：Forward5′- GAA，GGT，GAA，GGT，CGG，AGT，C -3′，Reverse5′- GAA，GAT，GGT，GAT，GGG，ATT，TC-3′，Probe5′(FAM)- CAA，GCT，TCC，CGT，TCT，CAG，CC -3′(TAMRA)。引物和探針均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒(Invitrogen)說明書進(jìn)行。熒光定量RT-PCR結(jié)果的計(jì)算：目的基因的標(biāo)準(zhǔn)值=2-(目的基因的Ct值-GAPDH的Ct值)，Ct值表示PCR循環(huán)閾值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所用數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0 for windows 統(tǒng)計(jì)軟件處理，良惡性腫瘤的比較采用t檢驗(yàn)， TMPRSS4與onfFN的相關(guān)性采用線性相關(guān)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TMPRSS4、onfFN的表達(dá)情況

RT-PCR結(jié)果顯示：甲狀腺癌和甲狀腺良性病變組織中TMPRSS4和onfFN mRNA的平均表達(dá)量分別為15.236±9.685、0.569±0.374和25.318±15.642、0.865±0.219，惡性與良性組織中兩者表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均=0.000)，2種分子標(biāo)志物在甲狀腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)性(γ=0.374,P=0.026)。

2.2 TMPRSS4和onfFN mRNA表達(dá)與甲狀腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

由表1可見， TMPRSS4 mRNA和onfFN mRNA的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小無相關(guān)性，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)(P=0.009、P=0.015和P=0.024、P=0.08)。

表1 OnfFN和TMPRSS4表達(dá)與甲狀腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

TMPRSS4功能上具有胰酶活性，可能在腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤過程中起重要作用，除了胰腺癌在其它惡性腫瘤中TMPRSS4表達(dá)水平也提高，例如胃癌、結(jié)腸癌和直腸癌等，在軟組織肉瘤和乳腺癌中不表達(dá)，在正常的心、腦、肺、肝、骨骼肌、胎盤、子宮和脂肪組織中不表達(dá)，而在正常消化道和泌尿生殖道中微量表達(dá)。由此可見，TMPRSS4表達(dá)存在著組織特異性和腫瘤特異性，并且這種表達(dá)的提高不出現(xiàn)在炎癥組織中，這些都表明它與腫瘤有著密切的關(guān)系[1]。關(guān)于TMPRSS4在甲狀腺癌中的表達(dá)情況研究的很少，Electron Kebebew等[2]通過cDNA微陣列技術(shù)篩選出差異表達(dá)基因TMPRSS4，并經(jīng)過定量RT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，它在甲狀腺癌中的高度表達(dá)，尤其是在濾泡樣癌和乳頭狀癌濾泡亞型中高度表達(dá)，但表達(dá)水平與原發(fā)腫瘤大小及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：TMPRSS4 mRNA在甲狀腺癌中的表達(dá)量高于甲狀腺良性腫瘤， TMPRSS4表達(dá)與腫瘤患者性別、年齡及腫瘤大小無關(guān)，而與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)和TNM分期有關(guān)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM Ⅲ+Ⅳ期的標(biāo)本中的表達(dá)水平要高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNMⅠ+Ⅱ期的組織，說明TMPRSS4在甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展過程中可能起到了至關(guān)重要的作用。

癌胚纖維連接蛋白(onfFN)是1個(gè)相對(duì)分子量為(310～335)×103的糖蛋白，正常情況下由子宮內(nèi)皮下的滋養(yǎng)層細(xì)胞和胚胎細(xì)胞分泌，作為胎盤的生物膠存在，在妊娠早期存在，而37周以后就會(huì)減少[3]。病理情況下在某些腫瘤組織細(xì)胞中高度表達(dá)，而在正常成人組織中不表達(dá)或微量表達(dá)，不同的腫瘤組織中表達(dá)也存在著明顯的差異，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。很多研究表明，onfFN在多種惡性腫瘤中高度表達(dá)，例如在肺癌、子宮等[4，5]中都有表達(dá)。在甲狀腺癌中它的表達(dá)水平同樣升高，E Hesse等[6]應(yīng)用cDNA微陣列技術(shù)，篩選出甲狀腺癌中onfFN的表達(dá)存在差異，應(yīng)用RT-PCR也證實(shí)了這一差異，發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌(PTC)中陽性率為98％，在甲狀腺濾泡癌(FTC)陽性率為78％。同時(shí)，監(jiān)測了外周血中正常細(xì)胞的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在正常的血細(xì)胞中無onfFN表達(dá)，這些說明通過檢測外周血中onfFN的表達(dá)可以用于甲狀腺微小轉(zhuǎn)移的監(jiān)測，將腫瘤組織的殘留降到最低，同時(shí)還可以用于評(píng)估惡性腫瘤治療方案的效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，onfFN mRNA在甲狀腺癌中的表達(dá)量要高于良性甲狀腺病變，同時(shí)，onfFN表達(dá)與腫瘤患者性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)，而與患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM Ⅲ+Ⅳ期標(biāo)本中onfFN表達(dá)要高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNMⅠ+Ⅱ期組織，并且onfFN與TMPRSS4在甲狀腺癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，說明onfFN與TMPRSS4一樣可能在甲狀腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中起到一定的作用，而且在此過程中兩者起到了協(xié)同作用。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)甲狀腺癌分子標(biāo)志物的研究會(huì)越來越深入，相信它在臨床的應(yīng)用前景非常廣闊，尤其是與細(xì)針吸細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合后，對(duì)甲狀腺病變的術(shù)前診斷和鑒別診斷具有很高的臨床實(shí)用價(jià)值，為臨床制定治療方案提供準(zhǔn)確的信息。

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[4]Nanki N,Fujita J,Yang Y,et al.Expression of oncofetal fibronectin and syndecan-1 mRNA in 18 human lung cancer cell lines〔J〕.Tumour Biol,2001,22(6):390.

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[6]E Hesse,PB Musholt,E Potter，et al.Oncofoetal fibronectin-a tumour-specific marker in detecting minimal residual disease in differentiated thyroid carcinoma〔J〕.British Journal of Cancer ,2005,93:565.