張景華 張德才 何 津 汪 萍 馬 杰 牛鳳玲

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，癌細胞轉移是導致發(fā)病率和死亡率上升，影響乳腺癌治療效果的主要原因。我們對乳腺癌組織、乳腺纖維腺瘤組織中VEGF mRNA及其蛋白表達水平進行檢測，同時分析其與HER-2，ER,PR蛋白表達的關系以及其在乳腺癌臨床生物學中的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2007年7月至2008年5月華北煤炭醫(yī)學院附屬唐山市腫瘤醫(yī)院乳腺腫瘤科女性乳腺癌48例和乳腺纖維腺瘤患者20例為研究對象，患者年齡(55.3±9.97)(29～79)歲?；颊咝g前未接受任何相應治療，且資料完整。為了排除不同病理分類對研究的影響，故納入本實驗中的48例乳腺癌全部為浸潤性導管癌。每例標本離體5 min內將各組織各0.1 g，置于液氮中暫存，液氮速凍后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(Real-time fluorescence quantitative RT-PCR)檢測乳腺癌組織中VEGF mRNA表達 ① 引物設計、合成由Genebank中查出基因的位置，用Primer 5.0設計引物，并由北京三博遠志生物技術有限公司合成。VEGF上游引物5'-GGAGGCAGAGAAAAGAGAAAG-3'，下游引物 5'-TCAGGGAGAGAGAGTTGG- AA-3'。GADPH 上游引物5'-GACACCCACTCCTCCACCTTT-3'，下游引物5'- CTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3'。② 組織總RNA的提?。翰捎肨rizol(invitrogen公司)一步法，按說明書操作。稱取約100 mg凍存的組織塊，置冰上，勻漿管內充分勻漿，反復離心，洗脫，提取總RNA，紫外分光光度儀測定其純度和含量，1％甲醛變性凝膠電泳檢測其完整性。③ cDNA 的合成：取RNA約2 μg加入逆轉錄反應體系( 10×PCR 反應緩沖液 2 μl,dNTP混合液 2 μl ，Oligo-dT15 2 μl，正向引物1 μl ，反向引物1 μl，加去離子雙蒸水至終反應體系20 μL，37℃孵育60 min。④ PCR擴增：反應體系20×SYBR solution 9 μl，正向引物1 μl，反向引物1 μl，DNA模板2 μl，加超純水至20 μl。將PCR反應管置入ROTOR GENE 3000實時定量PCR儀內， 95℃預變性5 min， 94℃變性30 s，58℃退火 1 min， 72℃延伸 1 min，40個循環(huán)反應結束，得出目的基因的Ct值。Ct值為設熒光強度閾值0.05時的循環(huán)數(shù)，以目的基因的Ct值減去內參GAPDH的Ct值得到△ct值，2-△ct即為目的基因相對于內參GAPDH的相對表達量[1]。提取的總RNA經瓊脂糖凝膠電泳，觀察28 s和18 s條帶，以條帶清晰且28 s的亮度約為18 s的二倍為最佳標準。用紫外分光光度計260 nm定量OD260/OD280比率進行純度測定，比值在1.8～2.0為最佳，2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2 PCR擴增產物特異性的確定 PCR產物經單一熔解曲線峰進行確定，并將PCR產物采用2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察，與DNA分子量參照物(markers)對比基因大小，以出現(xiàn)明顯與目的基因堿基相同的區(qū)帶為陽性。

1.2.3 免疫組化檢測乳腺癌組織中VEGF蛋白的表達 濃縮型兔抗人VEGF多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司；1∶50)。即用型SABC試劑盒及濃縮型DAB顯色試劑盒(武漢博士德)。取乳腺癌、乳腺良性腫瘤組織標本經10％福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm切片，常規(guī)免疫組化SABC法進行染色。對照以0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定標準

以細胞質中有棕黃色顆粒為陽性細胞。VEGF,ER,PR免疫組化陽性判定標準采用4級分法：無陽性細胞為(-)，0分；陽性細胞數(shù)≤25％為(+)，1分；>25％～50％為(++)，2分；>50％為(+++)，3分。再結合染色強度：無著色細胞為(-)，0分；淺黃色為(+)，1分；棕黃色(++)，2分；棕褐色為(+++)，3分。2個分值相加即為該標本的免疫組化陽性計分：0～1分為陰性，記為(-)；2～3分為弱陽性，記為(+)；4分為中度陽性，記為(++)；5分以上強陽性，記為(+++)。在本研究的統(tǒng)計中，將陰性患者記為(-)，其他3個級別的陽性患者均統(tǒng)計為(+)。HER-2的檢測標準依據(jù)美國臨床腫瘤學會(ASCO)和美國病理學家學會報告進行，陽性定義為：免疫組織化學染色(+++)[2]

1.4 統(tǒng)計學方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。陽性率的比較應用χ2檢驗、秩和檢驗及精確概率法，應用Spearman進行相關分析；計量資料采用方差分析，均以P<0.05作為判斷差別顯著性的標準。

2 結果

2.1 VEGF在乳腺癌及乳腺纖維腺瘤組織中的表達

VEGF mRNA見2條特異性條帶228 bp、365 bp分別代表VEGF121、VEGF165 2種異構體(圖1)。PCR產物半定量分析:VEGF121mRNA、VEGF165mRNA在乳腺癌中表達分別是0.5733±0.1764、0.310±0.098；在乳腺纖維腺瘤中表達為0.2961±0.0845、0.2657±0.0342。乳腺癌組織的VEGFmRNA陽性表達率均顯著高于乳腺纖維腺瘤組織(P<0.05),VEGFmRNA在乳腺癌細胞中表達擴增，見圖2。VEGF蛋白主要表達在胞質中，光學顯微鏡示胞質內含有棕黃色或棕褐色顆粒的細胞被計數(shù)為陽性細胞。VEGF在乳腺癌和乳腺纖維腺瘤組織中的陽性表達率分別為95.8％(46/48)、10.0％(2/20)。VEGF在2種組織中陽性率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=38.140，P=0.000)。實時熒光定量RT-PCR與免疫組化結果基本一致。

圖1 乳腺癌組織中VEGF mRNA表達的PCR產物凝膠電泳分析圖2 乳腺癌組織VEGF mRNA的擴增曲線結果

2.2 HER-2在乳腺癌及乳腺纖維腺瘤中的表達

HER-2在乳腺癌及乳腺纖維腺瘤中的表達分別為18.8％(9/48)、0(0/20)，兩者差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 VEGF、HER-2蛋白表達與乳腺癌臨床病理學及其生物學特性的關系

乳腺癌組織的VEGF蛋白表達與患者的年齡、淋巴結轉移、腫塊大小、組織學分級、pTNM分期等臨床病理因素無關(P>0.05)。HER-2蛋白表達與pTNM分期相關(P<0.05)，見表1。

2.4 乳腺癌中VEGF，HER-2，ER,PR蛋白表達的相關性

Spearman進行相關分析:VEGF的蛋白表達與HER-2，ER,PR不相關(P>0.05)。HER-2與ER,PR的表達呈負相關(γ=-0.335，P=0.005；γ=-0.300，P=0.012)，見表2。

表1 VEGF,HER-2蛋白表達與乳腺癌臨床病理因素的關系

表2 乳腺癌中VEGF、HER-2、 ER、PR的相關性

注：Spearman相關分析：HER-2與ER,PR的表達呈負相關，P<0.05

3 討論

1983年發(fā)現(xiàn)的血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)，在1989年被證實與牛垂體濾泡星狀細胞體外培養(yǎng)液中首先純化出來的VEGF是由同一基因編碼的同種蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)VEGF有5種異構體，即VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206。本研究結果檢測到乳腺組織中VEGF mRNA有2種,即VEGF121和VEGF165。VEGF145、VEGF189和VEGF206未檢測出,可能因其含量太少,或與其具有組織特異性有關。Scott等[3]研究發(fā)現(xiàn)VEGF mRNA在乳腺癌中表達顯著高于正常乳腺組織(121>165>189),只有VEGF165蛋白能表達。Jobim等[4]對VEGF的表達與乳腺癌的臨床病理特征關系的研究表明，VEGF的陽性表達與患者的年齡、腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移均沒有相關性。Yamasaki等[5]檢測VEGF mRNA在乳腺癌組織中表達，同樣未發(fā)現(xiàn)與腫瘤大小及淋巴結狀態(tài)有關，與本研究結果一致。

原癌基因HER-2，又稱C-erbB-2或neu，是生長因子受體家族成員之一，位于染色體17q21。該基因的表達產物為185 kD的跨膜糖蛋白,具有酪氨酸激酶活性，可促使腫瘤細胞發(fā)生惡性轉化。Hussein等[6]研究發(fā)現(xiàn)原癌基因HER-2在乳腺癌中的陽性表達率為10％～34％，其表達與預后不良有關，尤其在浸潤性導管癌中HER-2蛋白的表達明顯高于導管內癌；另外證明HER-2與ER呈負相關，即該基因的激活在ER陰性的腫瘤患者中較常見。本研究結果也支持前述研究，即HER-2的陽性表達率為18.8％，HER-2與ER、PR均呈負相關(P<0.05)。本研究還證明，HER-2蛋白陽性表達率與年齡、淋巴結轉移情況、腫瘤大小、組織學分級無關(P>0.05)，但HER-2在不同pTNM分期的乳腺癌患者中陽性表達有顯著差異，說明HER-2的表達與乳腺癌患者的分期相關，提示HER-2基因可能作為判斷乳腺癌預后的1個重要參考指標。

實時RT-PCR是1種能精確測定基因mRNA表達水平的熒光檢測系統(tǒng),在每一個RT-PCR循環(huán)的延伸階段,基因產物都有一次定量檢測,這種新方法和傳統(tǒng)RT-PCR相比有很多優(yōu)點。本研究中應用實時熒光定量RT-PCR檢測乳腺癌組織、乳腺纖維腺瘤的VEGF mRNA的表達情況，用免疫組化方法檢測其蛋白和HER-2與、ER、PR蛋白的關系。我們發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織的VEGF mRNA和蛋白的陽性表達率均顯著高于乳腺纖維腺瘤組織，VEGF在不同年齡、淋巴結轉移狀況、組織學分級、腫瘤大小、pTNM分期的乳腺癌患者中表達差異無統(tǒng)計學意義。HER-2在乳腺癌患者中的表達與ER,PR的表達成負相關。

[1]Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△CT Method〔J〕.Methods,200l,25(4):402.

[2]Wolff AC,Hammond ME,Schwartz JN,et al.American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer〔J〕.J Clin Oncol，2007，25(1):118.

[3]Scott PA,Smith K,Poulsom R,et al.Differential expression of vascular endothelial growth factor mRNA vs protein isoform expression in human breast cancer and relationship to eIF-4E〔J〕.Br J Cancer,1998,77(12):2120.

[4]Jobim FC,Schwartsmann G,Xavier NL,et al.Expression of MMP-9 and VEGF in breast cancer:correlation with other prognostic indicators〔J〕.Rev Bras Ginecol Obstet,2008,30(6):287.

[5]Yamasaki T,Tsuda H,Imazeki N,et al.Vascular endothelial growth factor mRNA levels quantified by reverse transcription-polymerase chain reaction in microdissected breast carcinoma tissues are correlated with histological type and grade of both invasive and intraductal components〔J〕.Pathol Int,2005,55(5):255.

[6]Hussein MR,Abd-Elwahed SR,Abdulwahed AR.Alterations of estrogen eceptors,progesterone receptors and C-erbB-2 oncogene protein expression in ductal carcinomas of the breast〔J〕.Cell Biol Int,2008,32(6):698