王紅鮮 陶霖玉 齊 柯 張好云 馮 鐸 孔 恒 林秋生 陳天文

趨化因子及其受體家族在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色。CXCR7，以前稱“孤兒G蛋白偶聯(lián)受體(RDC1)”，屬于趨化因子受體家族，是一條肽鏈的7-跨膜受體，與趨化因子-12(CXCL12)具有高親和力，表達于許多腫瘤細胞系，直接參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1]。

分子靶向治療是抗腫瘤特異性治療的最高層次。以細胞惡變的分子事件為治療靶點，從分子水平來逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性生物學(xué)行為，抑制腫瘤細胞生長，或阻斷細胞惡變的基礎(chǔ)和環(huán)境[2,3]，從根本上動搖和消滅腫瘤的方法和策略，已經(jīng)受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。本文采用RNA干擾的方法，通過構(gòu)建人結(jié)腸癌荷瘤裸鼠動物模型，在瘤體內(nèi)多點注射CXCR7的重組慢病毒shRNA表達載體，觀察其對荷瘤裸鼠瘤體生長的影響，探討體內(nèi)靶向抑制CXCR7的表達對結(jié)腸癌的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/c雌性4周齡裸鼠24只，體重12～14 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[許可證號SCXK(滬)2007-0005]，飼養(yǎng)于層流玻璃罩內(nèi)，飼料及飲水均經(jīng)滅菌處理。

1.2 細胞株

HT-29(人結(jié)腸癌細胞株)購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細胞中心，采用RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10％小牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，置5％CO2的37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 人CXCR7基因特異性RNAi慢病毒表達載體

設(shè)計人CXCR7基因(GeneBank，NM_020311)的siRNA靶點序列“gcagccggaagatcatcttct”(https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/design.do)，并經(jīng)Genebank數(shù)據(jù)庫BLAST檢索，確認無其它同源序列。合成CXCR7基因的shRNA片段(引物：Forward，5’-accacgcgtg gcagccggaagatcatcttctctctcttgaattc-3’；Reverse，5’-aaaatcgataaaaaa gcagccggaagatcatcttctgaattcaagagag-3’)，酶切shRNA互補雙鏈產(chǎn)生黏性末端，酶切plVTHM質(zhì)粒(干擾質(zhì)粒)使之線性化，37℃ 3h后電泳凝膠回收，采用T4連接酶連接，既得plVTHM-CXCR7shRNA重組質(zhì)粒。將慢病毒包裝的四質(zhì)粒系統(tǒng)(plVTHM-CXCR7shRNA重組質(zhì)粒，pRsv-Rev，pMDlg-pRRE和pMD2G)共轉(zhuǎn)染293T細胞，72 h后收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，并過濾、純化[2]。

1.4 人結(jié)腸癌動物模型的建立及分組

1.4.1 建立人結(jié)腸癌荷瘤裸鼠動物模型 常規(guī)胰酶消化生長狀態(tài)良好的人結(jié)腸癌細胞株HT-29，制成單細胞懸液，800 rpm/min離心5 min，PBS液清洗并重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至2.5×107/ml。

用1 ml注射器吸取HT-29細胞(約0.2 ml，含5×106個細胞)，接種于每只裸鼠背部皮下(注意勿接種到皮內(nèi))，1周左右100％成瘤(成瘤標(biāo)準(zhǔn)：瘤體直徑超過0.5 cm)。

1.4.2 動物分組 將人結(jié)腸癌荷瘤裸鼠隨機分為3組，每組8只，進行瘤體內(nèi)多點注射給藥。治療組：50 μl LV-CXCR7shRNA(4×108TU/ml)；陰性對照組：50 μl LV-shRNA negative control(4×108TU/ml)；空白對照組：50 μl PBS。

1.5 給藥后24天瘤體的體積與重量

人結(jié)腸癌荷瘤鼠瘤體內(nèi)給藥后第24天，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最長徑(a)和與之垂直的最短徑(b)，根據(jù)公式計算瘤體體積(V)：V=ab2×0.52(cm3)[3]。之后拉頸處死裸鼠，剝離皮下腫瘤，稱取瘤體重量。

1.6 Western blotting測定給藥后24天各組CXCR7蛋白表達

常規(guī)RIPA及PMSF提取各組荷瘤鼠瘤體總蛋白，取等量變性蛋白樣品于SDS-PAGE膠中電泳，在Bio-Rad半干式電轉(zhuǎn)儀中轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5％脫脂奶粉-PBST封閉非特異蛋白。用一抗(1∶500稀釋兔抗CXCR7，1∶1 000稀釋兔抗GAPDH)室溫孵育2 h，洗膜后再用二抗(1∶1 000稀釋的羊抗兔IgG-HRP)室溫孵育2 h，ECL顯色、曝光顯影，Gene Genius凝膠成像系統(tǒng)成像，Quantity One 4.62(Bio-Rad)凝膠分析軟件測定各條帶的光密度值，結(jié)果以積分光密度值(integral optical density，IOD)表示，以IODCXCR7/GAPDH作為CXCR7蛋白的相對量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，統(tǒng)計數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用S-N-K法，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 瘤體內(nèi)給藥后的腫瘤體積

在人結(jié)腸癌荷瘤裸鼠瘤體內(nèi)給藥后第24天，所有動物均存活。與2組對照組比較，治療組瘤體體積顯著縮小(P<0.05)；陰性對照組和空白對照組比較無顯著性差異(P<0.05)，見表1，結(jié)果表明靶向抑制CXCR7的表達，可使人結(jié)腸癌荷瘤鼠的瘤體生長顯著受抑。

表1 各組荷瘤鼠瘤體體積(±s)

表1 各組荷瘤鼠瘤體體積(±s)

組別n體積F值P值治療組80．90±0．1414．040．00陰性對照組81．35±0．23空白對照組81．42±0．17

2.2 瘤體內(nèi)給藥后24天的瘤重

拉頸處死荷瘤裸鼠，大體解剖未發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移灶，剝離皮下腫瘤，測量瘤體的重量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組瘤重顯著輕于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)；陰性對照組和空白對照組比較差異無顯著性(P>0.05)，見表2和圖1，提示慢病毒CXCR7shRNA表達載體能明顯抑制瘤體生長。

圖1 各組荷瘤鼠的瘤體組織

a1,a2為治療組； b1,b2為陰性對照組； c1,c2為空白對照組

表2 各組荷瘤鼠瘤體重量(±s)

表2 各組荷瘤鼠瘤體重量(±s)

組別n瘤重F值P值治療組80．39±0．134．9570．017陰性對照組80．63±0．19空白對照組80．58±0．17

2.3 瘤體組織中CXCR7蛋白表達水平

在大小約52 kD(目的蛋白CXCR7)和37 kD(內(nèi)參蛋白GAPDH)處，各組織標(biāo)本均有特異性條帶(圖2)。治療組CXCR7蛋白表達水平低于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(因液氮凍存罐炸裂，數(shù)個標(biāo)本丟失，故每組均等取6個標(biāo)本)；陰性對照組和空白對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表3和圖2，提示瘤體內(nèi)注射靶向CXCR7的shRNA慢病毒表達載體，能有效降低荷瘤裸鼠瘤體組織中CXCR7蛋白的表達水平。

圖2 Western blotting檢測CXCR7蛋白表達

表3 Western blotting檢測各組中CXCR7蛋白表達

3 討論

結(jié)腸癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展過程涉及一系列分子事件，趨化因子CXCL12及其受體CXCR4的異常表達是結(jié)腸癌生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[4]。CXCR7是近年發(fā)現(xiàn)與CXCL12具有高親和力的受體[5]。研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子受體CXCR7在許多人類惡性腫瘤中呈高表達，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等，且隨腫瘤侵襲性的增加而表達量增多，但在正常組織標(biāo)本中不表達或少表達[6]。S Iwakiri[7]研究發(fā)現(xiàn)，高表達CXCR7的Ⅰ期非小細胞性肺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率顯著增高、5年無瘤生存率明顯降低。

體外實驗證實CXCR7能提高腫瘤細胞的生長、黏附和侵襲能力[8～10]，CXCR7在體內(nèi)是否參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展？Burns[5]在小鼠腫瘤模型的研究中發(fā)現(xiàn)，CXCR7能調(diào)節(jié)惡性腫瘤的生物學(xué)性質(zhì)，促進腫瘤進展。有學(xué)者用CXCR7的小干擾RNA(small interference ribonucleic acid,siRNA)，使CXCR7在乳腺癌細胞株4T1中表達減少到10％，體內(nèi)成瘤性顯著降低[9]；將CXCR7序列導(dǎo)入乳腺癌細胞MDA-MB435s，體內(nèi)成瘤性顯著提高[9,11]；自小鼠尾靜脈分別注射上述2種轉(zhuǎn)染了CXCR7基因序列的腫瘤細胞，其肺部的轉(zhuǎn)移、侵襲能力顯著增加[9]。Burns等[5]從約10萬個小分子化合物中篩選出2個CXCR7拮抗劑，將表達CXCR7的腫瘤細胞接種至小鼠，同時給予拮抗劑處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接受拮抗劑處理的小鼠，其腫瘤的生長趨勢顯著降低。值得關(guān)注的是轉(zhuǎn)導(dǎo)CXCR7的正常細胞有惡性轉(zhuǎn)化潛能，將CXCR7導(dǎo)入小鼠成纖維細胞NIH-3T3能促進其增殖和成瘤[9]。BKSHV(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus)與人淋巴細胞增生性疾病和卡波肉瘤密切相關(guān)，裸鼠體內(nèi)實驗顯示CXCR7的siRNA能抑制KSHV感染所致的細胞惡性轉(zhuǎn)化[12]。上述結(jié)果提示CXCR7在惡性腫瘤的演變過程中可能發(fā)揮重要作用。

探討CXCR7對結(jié)腸癌生物學(xué)性質(zhì)的調(diào)控，有望為惡性腫瘤的治療提供了一個新的策略。本文以人結(jié)腸癌荷瘤裸鼠為研究對象，以CXCR7為分子靶標(biāo)，以shRNA重組慢病毒載體為治療介質(zhì)，研究靶向沉默CXCR7基因的表達對人結(jié)腸癌荷瘤裸鼠瘤體生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘤體的體積顯著減小、重量顯著減輕，CXCR7的靶向沉默效應(yīng)經(jīng)Western blotting檢測予以證實，提示靶向抑制CXCR7基因的表達能顯著抑制人結(jié)腸癌荷瘤裸鼠的瘤體生長，CXCR7可能參與促進結(jié)腸癌的惡性進展，是人結(jié)腸癌治療潛在的分子靶標(biāo)。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)誘發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因靜默機制，即同源性mRNA的降解，是研究基因功能、探討藥物治療靶標(biāo)的有力工具[13,14]。siRNA是RNAi的效應(yīng)分子[15]，但其穩(wěn)定性較差，容易被核酸酶降解，且不易透過生物膜。慢病毒以其轉(zhuǎn)染效率高、能將遺傳物質(zhì)整合到靶細胞基因組、可持續(xù)性表達等優(yōu)勢，為RNAi提供高效、安全、穩(wěn)定的表達載體。本文采用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾方法，從實驗動物水平探討CXCR7與人結(jié)腸癌的關(guān)系，以期為結(jié)腸癌的治療帶來新的方案。本文針對CXCR7基因序列設(shè)計的siRNA序列進行了嚴(yán)格的BLAST比對，以保證和其他基因的非同源性，提高對CXCR7靶基因沉默的特異性。

CXCR7的信號傳導(dǎo)及其對腫瘤調(diào)節(jié)機制尚不確切。推測其信號傳導(dǎo)可能是通過結(jié)構(gòu)性激活機制來活化細胞，此結(jié)構(gòu)性激活機制通過可逆性地與配體結(jié)合的形式活化。有報道[8]CXCR7參與上調(diào)TGF-β1(transforming growth factor-β1)的表達，后者可誘導(dǎo)上皮細胞向間葉細胞轉(zhuǎn)化，這與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。配體活化的CXCR7還可能激活A(yù)KT信號傳導(dǎo)通路，有利于腫瘤生長。此外，CXCR7可能誘導(dǎo)白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)和血管內(nèi)皮生長因子(vessel endothelium growth factor,VEGF)表達，參與調(diào)控腫瘤血管生成。趨化因子及其受體所調(diào)節(jié)的腫瘤生長微環(huán)境比以往的認識要復(fù)雜得多，值得學(xué)術(shù)界進一步探索發(fā)現(xiàn)。

[1]Balabanian K,Lagane B,Infantino S,et al.The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes〔J〕.J Biol Chem,2005,280(42):35760.

[2]王紅鮮,陳道瑾,胡 桂.shRNA慢病毒表達載體對人結(jié)腸癌細胞CXCR7表達的影響〔J〕.中國普通外科雜志,2009,18(2):156.

[3]Szajda SD,Jankowska A,Zwierz K.Carbohydrate markers in colon carcinoma〔J〕.Dis Markers,2008,25(4～5):233.

[4]Rubie C,Kollmar O,Frick VO,et al.Differential CXC receptor expression in colorectal carcinomas〔J〕.Scand J Immunol,2008,68(6):635.

[5]Burns JM,Summers BC,Wang Y,et al.A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival,cell adhesion,and tumor development〔J〕.J Exp Med,2006,203(9):2201.

[6]Goldmann T,Dr?mann D,Radtke J,et al.CXCR7 transcription in human non-small cell lung cancer and tumor-free lung tissues；possible regulation upon chemotherapy〔J〕.Virchows Arch,2008,452(3):347.

[7]S Iwakiri,M Sonobe,S Nagai,et al.Expression of CXCR7 in p-stage I non-small cell lung cancer increases the risk for postoperative recurrence at the distant site and correlates with poor disease free survival〔J〕.European Journal of Cancer Supplements,2008,6(9):157.

[8]Wang J,Shiozawa Y,Wang J,et al.The role of CXCR7/RDC1 as a chemokine receptor for CXCL12/SDF-1 in prostate cancer〔J〕.J Biol Chem,2008,283(7):4283.

[9]Balabanian K,Lagane B,Infantino S,et al.The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes〔J〕.J Biol Chem,2005,280(42):35760.

[10]Holger Knaut,Alexander F Schier.Clearing the path for germ cells.Cell,2008,132(3):337.

[11]Foerster B R,Luker K E,Luker G D.Role of CXCR7 in breast cancer using molecular imaging techniques〔J〕.FASEB Journal,2007,21(6):A775.

[12]Raggo C,Ruhl R,McAllister S,et al.Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus〔J〕.Cancer Res,2005,65(12):5084.

[13]Ohrt T,Schwille P.siRNA modifications and sub-cellular localization:a question of intracellular transport?〔J〕.Curr Pharm Des,2008,14(34):3674.

[14]Bahadori M.New Advances in RNAs〔J〕.Arch Iran Med,2008,11(4):435.

[15]Ma Y,Chan CY,He ML.RNA interference and antiviral therapy〔J〕.World J Gastroenterol,2007,13(39):5169.