曲利娟 楊 直 曾 玲 熊喜生

DR-nm23基因又稱nm23-H3或NME3(non-metastatic cell 3)，是迄今nm23腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因家族8個成員(nm23-H1～nm23-H8)之一，系1995年由Venturelli等[1]應(yīng)用cDNA文庫差異顯示篩選技術(shù)，從慢性粒細(xì)胞性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)急性發(fā)作期的原代細(xì)胞中克隆出。已知DR-nm23與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、黏附、侵襲等多種生物學(xué)行為有關(guān)，但該基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的報道甚少，尤其是與大腸癌組織的相關(guān)性研究未見報道。正常-腺瘤-癌順序是人類大腸癌的發(fā)生、發(fā)展模式，本研究采用核酸原位雜交和免疫組化方法，檢測正常腸黏膜組織、腺瘤及大腸癌組織中DR-nm23的表達(dá)水平，從mRNA和蛋白2個水平上探討DR-nm23與大腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例材料

選取南京軍區(qū)福州總醫(yī)院2006年～2008年收治的、經(jīng)病理檢查證實(shí)的大腸癌根治術(shù)標(biāo)本98例，其中大腸癌不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組59例，大腸癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組39例；39例轉(zhuǎn)移組中同時具有原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌29例。選取57例大腸管狀絨毛狀腺瘤為腺瘤組，其中腺瘤伴高級別上皮內(nèi)腫瘤35例，腺瘤伴低級別上皮內(nèi)腫瘤22例。另選取42例大腸癌無轉(zhuǎn)移組匹配鄰近正常黏膜組織為正常組。98例大腸癌組中，男性69例，女性29例，年齡27～79歲，中位年齡57.84歲。腫瘤發(fā)生部位：結(jié)腸46例，直腸52例。組織學(xué)類型：乳頭狀腺癌25例，管狀腺癌30例，黏液腺癌14例，低分化腺癌17例，印戒細(xì)胞癌12例。病理分級(參照2000年WHO分級標(biāo)準(zhǔn))：Ⅰ級25例，Ⅱ級44例，Ⅲ級29例。所有標(biāo)本經(jīng)10％中性福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 核酸原位雜交

DR-nm23 mRNA寡核苷酸探針序列為5’-ATCCCGCTCCCGCACCGCCATC-3’，由上海博亞公司合成并進(jìn)行5’端和3’端地高辛標(biāo)記。敏感性加強(qiáng)型原位雜交檢測試劑盒Ⅰ購自武漢博士德公司。按試劑盒說明書進(jìn)行核酸雜交：切片脫蠟入水，3％ H2O2甲醇阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育10 min；PBS 5 min×3，蒸餾水5 min×1；3％檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶暴露mRNA核酸片段，37℃消化20 min，PBS 5 min×3，雙蒸餾水5 min×1；滴加20 μl加預(yù)雜交液，37℃、4 h；吸去多余預(yù)雜交液，不洗；滴加20 μl雜交液，37℃、雜交12～16 h；雜交后洗滌；滴加封閉液，37℃、30 min；甩去多余液體，不洗；滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃、60 min；PBS 5 min×4；滴加SABC，37℃、20 min；PBS 5 min×3；滴加生物素化過氧化物酶，37℃、20 min；PBS 5 min×4；DAB顯色；蘇木精復(fù)染，鹽酸分化，水洗反藍(lán)；封固，光鏡下觀察。用不加探針的雜交液作為陰性對照。

1.3 免疫組織化學(xué)

濃縮型羊抗人DR-nm23(編號SC-50945)多克隆抗體及即用型SABC免疫組化試劑盒，分別購自美國Santa Cruz 生物技術(shù)公司和武漢博士德生物工程有限公司。采用SP法免疫組織化學(xué)法染色：切片脫蠟入水，組織抗原高壓修復(fù)1 min 40 s，PBS 5 min×2；3％ H2O2阻斷過氧化氫酶活性10 min，PBS 5 min×2；正常兔血清室溫孵育15 min；羊抗人DR-nm23抗體(工作濃度1∶300)，4℃過夜12 h，PBS 3 min×3；生物素標(biāo)記二抗室溫孵育15 min，PBS 3 min×3；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素室溫孵育15 min，PBS 3 min×3；DAB顯色，顯微鏡下觀察，水洗終止；蘇木精復(fù)染，鹽酸分化，水洗反藍(lán)；封固，光鏡下觀察。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷

DR-nm23 mRNA雜交信號和DR-nm23蛋白陽性表達(dá)顆粒主要定位于細(xì)胞質(zhì)。每張切片根據(jù)陽性率和雜交信號(或)著色強(qiáng)度分別進(jìn)行評分：無著色為0分，淺黃色為1分，淺棕色為2分，深棕色為3分；5％以下為0分，6％～25％為1分，26％～50％為2分，51％～75％為3分，76％以上為4分。根據(jù)陽性率和雜交信號(或)著色強(qiáng)度兩項(xiàng)評分的乘積進(jìn)行評價，結(jié)果分為3級：0～4分為陰性(-)，5～8分為弱陽性表達(dá)(+)，9～12分為強(qiáng)陽性表達(dá)(++)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件包，進(jìn)行多個獨(dú)立樣本非參數(shù)Kruskal-Wallis Test檢驗(yàn)和兩獨(dú)立樣本非參數(shù)Mann-Whitney Test檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 正常組、腺瘤組和大腸癌組中DR-nm23表達(dá)情況

正常組中DR-nm23 mRNA表達(dá)率為76.2％(32/42)，而腺瘤組(21/57，36.8％)、大腸癌組中其表達(dá)率(41/98，41.8％)均下降，3組表達(dá)差異顯著(χ2=21.866，P<0.01)；兩兩比較，正常組與腺瘤組(Z=-3.538，P<0.01)、正常組與大腸癌組(Z=-4.618，P<0.01)比較差異均顯著，腺瘤組與大腸癌組比較差異不顯著(Z= -0.093，P>0.05)。正常組DR-nm23蛋白表達(dá)率為71.4％(30/42)，腺瘤組(22/57，38.6％)、大腸癌組其表達(dá)率(25/98，35.7％)均下降，3組表達(dá)差異顯著(χ2= 25.852，P<0.01)；兩兩比較，正常組與腺瘤組(Z=-4.385，P<0.01)、正常組與大腸癌組(Z=-4.606，P<0.01)比較差異均顯著，腺瘤組與大腸癌組比較差異不顯著(Z=-0.024，P>0.05)，見表1。雜交信號和陽性顆粒均定位于細(xì)胞質(zhì)。

表1 正常組、腺瘤組及大腸癌組中DR-nm23的表達(dá)情況(例，％)

與正常組比較，※為P<0.01；與腺瘤組比較，#為P>0.05

2.2 腺瘤組中低、高級別上皮內(nèi)腫瘤DR-nm23的表達(dá)

低級別組DR-nm23 mRNA表達(dá)率為45.5％(10/22)，高級別組其表達(dá)率(31.4％，11/35)下降，2組比較差異不顯著(Z=-0.995，P>0.05)。DR-nm23蛋白低級別組表達(dá)率為59.1％(13/22)，高級別組(25.7％，9/35)其表達(dá)率下降，2組比較差異有顯著性(Z=-2.646，P<0.01)，見表2。

表2 腺瘤組低級別與高級別上皮內(nèi)腫瘤中DR-nm23的表達(dá)情況(例，％)

2.3 DR-nm23表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系

DR-nm23 mRNA表達(dá)與腫瘤病理分級密切相關(guān)(χ2=9.473，P<0.01)，分化越好，其表達(dá)率越高；其表達(dá)與大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)性(Z=-3.555，P<0.05)，但與大腸癌組織學(xué)類型無相關(guān)性(χ2=9.142，P>0.05)。DR-nm23蛋白表達(dá)不僅與大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)性(Z=-2.156，P<0.05)，而且與大腸癌組織學(xué)類型(χ2=13.731)和病理分級(χ2=12.198)相關(guān)(P<0.01)，見表3。

表3 DR-nm23表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系(例，％)

2.4 大腸癌轉(zhuǎn)移組原發(fā)癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中DR-nm23的表達(dá)

原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中DR-nm23 mRNA(Z=-1.188)及其蛋白(Z=-0.585)的表達(dá)差異均不顯著(P>0.05)，見表4。

表4 大腸癌轉(zhuǎn)移組原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中DR-nm23的表達(dá)情況(例，％)

3 討論

轉(zhuǎn)移是大腸癌的重要生物學(xué)行為，是患者死亡主要原因之一。大量研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移過程涉及一系列復(fù)雜的分子事件，是多步驟、多因素、多基因共同參與的復(fù)雜病理過程。其中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1與大腸癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性已得到公認(rèn)。DR-nm23又稱nm23- H3是nm23腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因家族成員之一，基因定位于染色體16q13，cDNA全長849 bp，由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，結(jié)構(gòu)與nm23-H1和nm23-H2具有65％～70％高度同源性，但啟動子結(jié)構(gòu)與該家族其他成員不同，幾乎不含經(jīng)典的TATA框或CAAT框，而富含G+C[1]。位于上游遠(yuǎn)端核苷酸+136～+143及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游核苷酸-1028～-523處有SP1、Ap-2、Myb、ets、GATA和Hox-1等多個轉(zhuǎn)錄起始因子相關(guān)元件結(jié)合位點(diǎn)，參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄效率及活性，激活DR-nm23基因的表達(dá)[1，2]。DR-nm23基因所編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是二磷酸核苷激酶(nucleoside diphosphate kinase，NDPK)，NDPK的主要生理功能包括[3～5]：①具有組氨酸蛋白激酶活性，即通過磷酸組氨酸中間產(chǎn)物將與蛋白質(zhì)結(jié)合的二磷酸核苷可逆磷酸化為三磷酸核苷，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量池大小，活化蛋白質(zhì)，從而參與蛋白質(zhì)各種功能的活動。②參與絲氨酸磷酸化及轉(zhuǎn)錄激活等。③具有ATP活性，參與CTP、UTP及GTP的生物合成。

研究表明，NDPK活性是nm23家族的共同特性，與細(xì)胞的分化和增殖活動密切相關(guān)[6～8]，但分子機(jī)制并不十分清楚。nm23家族成員在不同組織的表達(dá)和生物學(xué)功能不盡相同。nm23-H1與多種腫瘤轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)[7]，nm23-H2調(diào)控c-myc原癌基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞的生長、分化[8]；nm23-H4調(diào)節(jié)線粒體功能，與腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[9]；睪丸特異性表達(dá)基因nm23-H5和nm23-H6～H8均被證實(shí)具有NDPK活性或NDPK樣區(qū)域，推測可能參與腫瘤的形成和進(jìn)展機(jī)制[10]。DR-nm23在CML、星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、部分實(shí)體瘤如乳腺癌、胰腺癌、大腸癌、前列腺癌等均有表達(dá)。Venturelli等[11]研究發(fā)現(xiàn)DR-nm23在CML慢性期高表達(dá)，通過抑制粒細(xì)胞集落刺激因子誘導(dǎo)粒細(xì)胞分化，同時促進(jìn)粒細(xì)胞凋亡，參與CML的發(fā)生、并使病情處于相對穩(wěn)定狀態(tài)；而在CML進(jìn)展期DR-nm23表達(dá)下調(diào)或缺失，粒細(xì)胞分化嚴(yán)重抑制甚至停滯，使髓前體細(xì)胞過度增殖，病情急轉(zhuǎn)直下向急性發(fā)作期轉(zhuǎn)化。提示DR-nm23在造血細(xì)胞分化早期發(fā)揮重要作用，DR-nm23基因的突變、缺失和CML不同階段的差異表達(dá)，可能與CML的發(fā)生、發(fā)展和惡化密切相關(guān)。Huang等[12]研究顯示DR-nm23在正常腦組織中不表達(dá)，星形細(xì)胞瘤表達(dá)上調(diào)，表達(dá)與星形細(xì)胞瘤的發(fā)生有關(guān)。Amendola等[13，14]研究表明神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化越好DR-nm23表達(dá)水平越高； DR-nm23通過降低SK-N-SH神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株的細(xì)胞外基質(zhì)的黏附性，促進(jìn)Ⅳ型膠原增生，增加波形蛋白表達(dá)，從而抑制瘤細(xì)胞生長。這一特性在鼠NLE-15神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株的表現(xiàn)也得到驗(yàn)證，研究顯示DR-nm23高表達(dá)能促進(jìn)瘤細(xì)胞軸突快速生長，使β-整聯(lián)蛋白顯著增多，Ⅰ型膠原蛋白黏附性增加，抑制瘤細(xì)胞生長。此外，DR-nm23基因突變可減弱細(xì)胞分化能力，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[15]。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在mRNA和蛋白兩個水平，大腸癌組DR-nm23表達(dá)均較正常組、腺瘤組低，表達(dá)差異極顯著；兩兩比較，正常組與腺瘤組、正常組與大腸癌組的表達(dá)差異均顯著，但腺瘤組與大腸癌組間表達(dá)差異不顯著；腺瘤組中高級別上皮內(nèi)腫瘤表達(dá)較低級別上皮內(nèi)腫瘤下調(diào)。提示DR-nm23基因及其蛋白產(chǎn)物的表達(dá)水平下調(diào)與大腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且可能主要參與上皮內(nèi)瘤變等癌前病變的過程。結(jié)果還顯示：DR-nm23基因表達(dá)與腫瘤病理分級相關(guān)，但與組織學(xué)分型無關(guān)；DR-nm23蛋白表達(dá)與腫瘤病理分級和組織學(xué)分型均有相關(guān)性，提示DR-nm23參與了大腸癌細(xì)胞的分化，癌細(xì)胞分化越好，DR-nm23表達(dá)率越高。

本組中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組DR-nm23基因及蛋白表達(dá)較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高，表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)性，結(jié)果與孫青等[16]一致，提示DR-nm23可作為反映大腸癌生物學(xué)行為和預(yù)后的潛在重要指征之一。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示：轉(zhuǎn)移組中，原發(fā)癌與其匹配淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌DR-nm23在mRNA和蛋白水平表達(dá)差異不顯著，從另一方面也提示了大腸癌從原發(fā)灶向轉(zhuǎn)移灶轉(zhuǎn)移的過程，不僅是多基因、多因素、多機(jī)制共同參與的復(fù)雜病理過程，而且表達(dá)水平在轉(zhuǎn)移過程中也可能發(fā)生相應(yīng)變化。

[1]Venturelli D，Martinez R，Melotti P，et al.Overexpression of DR-nm23，a protein encoded by a member of the nm23 gene family，inhibits granulocyte differentiation and induces apoptosis in 32Dc13 myeloid cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1995,92(16): 7435.

[2]曲利娟,丁彥青.DR-nm23基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.國外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊，2005,32(5):336.

[3]Lacombe ML，Tokarska-Schlattner M，Epand RF，et al.Interaction of NDPK-D with cardiolipin-containing membranes: Structural basis and implications for mitochondrial physiology〔J〕.Biochimie，2009,91(6):779.

[4]Miyamoto M，Iwashita S，Yamaguchi S，et al.Role of nm23 in the regulation of cell shape and migration via Rho family GTPase signals〔J〕.Mol Cell Biochem，2009,329(1～2):175.

[5]Postel EH，Zou X，Notterman DA，et al.Double knockout Nme1/Nme2 mouse model suggests a critical role for NDP kinases in erythroid development〔J〕.Mol Cell Biochem，2009，329(1～2):45.

[6]Postel EH.Multiple biochemical activities of NM23/NDP kinase in gene regulation〔J〕.J Bioenerg Biomembr，2003，35(1): 31.

[7]Kim HD，Youn B，Kim TS，et al.Regulators affecting the metastasis suppressor activity of Nm23-H1〔J〕.Mol Cell Biochem，2009,329(1-2):167.

[8]Thakur RK，Kumar P，Halder K，et al.Metastases suppressor NM23-H2 interaction with G-quadruplex DNA within cM- YC promoter nuclease hypersensitive element induces c-MYC expression〔J〕.Nucleic Acids Res，2009,37(1):172.

[9]Tokarska-Schlattner M，Boissan M，Munier A，et al.The nucleoside diphosphate kinase D(NM23-H4)binds the inner mitochondrial membrane with high affinity to cardiolipin and couples nucleotide transfer with respiration〔J〕.J Biol Chem，2008,283(38):26198.

[10]Munier A，Serres C，Kann ML，et al.Nm23/NDP kinases in human male germ cells: role in spermiogenesis and sperm motility?〔J〕.Exp Cell Res，2003，289(2): 295.

[11]Venturelli D，Cesi V，Ransac S，et al.The nucleoside diphosphate kinase activity of DR-nm23 is not required for inhibition of differentiation and induction of apoptosis in 32Dcl3 myeloid precursor cells〔J〕.Exp Cell Res，2000，257(2): 265.

[12]Huatao Huang，Colella S，Kurrer M，et al.Gene expression profiling of low-grade diffuse astrocytomas by cDNA arrays〔J〕.Cancer Res，2000，60(24): 6868.

[13]Amendola R，Martinez R，Negroni A，et al.DR-nm23 gene expression in neuroblastoma cells: relationship to integrin expression，adhesion characteristics，and differentiation〔J〕.J Natl Cancer Inst，1997，89(17):1300.

[14]Amendola R，Martinez R，Negroni A，et al.DR- nm23 expression affects neuroblastoma cell differentiation，integrin expression，and adhesion characteristics〔J〕.Med Pediatr Oncol,2001,36(1): 93.

[15]Negroni A，Venturelli D，Tanno B，et al.Neuroblastoma specific effects of DR-nm23 and its mutant forms on differentiation and apoptosis〔J〕.Cell Death Differ，2000，7(9): 843.

[16]孫 青,丁彥青,高雪芹.腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)cDNA基因芯片的制備與應(yīng)用〔J〕.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2002,22(12):1070.